整合素(integrins)是一类重要细胞粘附分子受体,它介导细胞与细胞之间、细胞与胞外基质(extracellular matrix, ECM)的粘连,也参与细胞内外信息传递。整合素由一个α亚基和一个p亚基构成。目前已经发现18种α亚基和9种p亚基,这些亚基通过不同组合方式构成至少25种整合素。在它们当中,整合素α5β,是纤维连接蛋白的受体,当细胞接触到胞外基质纤维连接蛋白,整合素α5p1被激活。然而,我们身体内大部分纤维连接蛋白是可溶性的,可溶性的纤维连接蛋白主要存在血浆中,随着血液到达我们身体的每一个部分。还没有证据表明可溶性的纤维连接蛋白是否也活化整合素介导的信号通路。RhoA是小G蛋白超家族中Rho家族主要成员,它介导的信号与细胞骨架的重排,迁移,增殖和基因表达等相关。研究发现,多种肿瘤细胞过度表达RhoA,当RhoA的活性被抑制时,癌细胞浸润性生长和转移也被抑制。许多的研究资料证明整合素和RhoA之间有着关联,但确切的机制尚不清楚。PKA是与cAMP信号通路相关的蛋白激酶。PKA是由4个亚基组成的一种别构酶,由两个催化亚基C和两个调节亚基R所构成。当cAMP结合R亚基后,全酶快速解离,C亚基变得有催化活性,可以磷酸化特异性底物。有资料显示PKA能够抑制RhoA的活性和功能。整合素、RhoA和PKA之间可能的相互作用还不清楚。研究目的：探讨可溶性纤维连接蛋白／整合素、cAMP/PKA和RhoA介导的信号通路之间的关系。主要研究可溶性纤维连接蛋白对细胞骨架、RhoA活性及cAMP含量和PKA活性的作用。研究方法：(1)以异硫氰四甲基罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽,对细胞骨架微丝F-actin进行染色,观察细胞骨架的变化。(2)将培养好的PC-3细胞,药物处理后,通过倒置显微镜动态观察细胞形态的变化。(3)通过pull down assay方法,观察RhoA活性的变化。(4)通过放射免疫的方法,检测cAMP的含量。(5)通过免疫荧光方法,观察PKACα的分布。(6)采用Western Blot方法,观察PKACα及的p-VASP蛋白的含量。(7)将报告基因质粒CRE-luciferase及参照基因质粒P-Galactosidase共同转染入SGC-7901细胞,药物处理后,用荧光虫素酶报告基因方法分析报告基因表达的活性。(8)将野生型Ht31质粒与GFP质粒共同转染SGC-7901细胞,用药物G418进行筛选,并用有限稀释法得到稳定表达Ht31的细胞。(9)将稳定表达AKAP抑制性肽段Ht31的SGC-7901细胞接种到二十四孔板中。药物处理后,细胞用鬼笔环肽进行染色,并在荧光显微镜下观察细胞骨架微丝F-actin的形成变化。研究结果：(1)可溶性纤维连接蛋白可以使PC-3细胞细胞发生明显的形态改变,使用与RhoA相关的激酶Rock的抑制剂Y27632及α5β1抗体后,这种作用被取消。(2)可溶性纤维连接蛋白提高RhoA活性,具有时间和剂量依从性；事先使用α5β1抗体后,可溶性纤维连接蛋白提高RhoA活性作用被抑制；PKA对RhoA活性有抑制作用,纤维连接蛋白可减弱这种作用。(3)可溶性纤维连接蛋白可抑制由Forskolin或百日咳毒素(PTX)导致的cAMP含量的升高。(4)可溶性纤维连接蛋白可抑制由Forskolin或百日咳毒素(PTX)导致的PKACa含量的升高。(5)可溶性纤维连接蛋白可抑制由Forskolin导致的p-VASP含量的增加和CRE依赖的基因转录水平的升高。对cAMP导致的p-VASP含量的增加和CRE依赖的基因转录水平的升高影响不大。(6)筛选得到稳定表达Ht31的细胞克隆用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实在37KD和27KD左右分别有两条特异蛋白条带。(7)可溶性纤维连接蛋白促进F-actin的形成,且具有剂量依从性。PKA对纤维连接蛋白引起的F-actin形成有抑制作用。PKA在锚定被破坏时,这种抑制作用被削弱。结论(1)可溶性的纤维连接蛋白也通过α5β1活化整合素介导的信号通路。(2)可溶性纤维连接蛋白能促进细胞骨架微丝F-actin的形成,使细胞发生明显的形态改变,这些效应与RhoA、PKA相关。(3)可溶性纤维连接蛋白能够提高RhoA活性,并可拮抗PKA对RhoA活性的抑制作用。(4)可溶性纤维连接蛋白能够对cAMP/PKA介导的信号通路有抑制作用,可能的作用靶点是腺苷酸环化酶。我们的研究结果不仅有助于我们了解纤维连接蛋白／整合素、cAMP/PKA信号和RhoA介导的信号转导通路之间的关系,而且还为癌症治疗策略提供了新靶点。