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研究背景:罗米地辛是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACi),也是一种表观遗传学调控药物,已用于皮肤T细胞淋巴瘤的治疗。目前体外及动物实验显示HDACi对脑膜瘤等实体肿瘤具有抑制作用,HDACi还可以作为免疫抑制剂,用于器官移植,维持移植器官的存活。研究发现HDACi可以上调肿瘤细胞表面的PD-L1分子。在肿瘤患者体内,肿瘤细胞表面的PD-L1分子,与T细胞上的PD-1分子相互结合,帮助肿瘤细胞逃避T细胞的攻击,促使肿瘤细胞发生免疫逃逸。Anti-PD-1抗体主要与T细胞表面的PD-1分子结合,阻断肿瘤细胞表面PD-L1与T细胞的PD-1分子结合,恢复T细胞的功能。结肠癌是消化系统的常见肿瘤,本研究旨在探索罗米地辛是否具有抗结肠癌的作用,罗米地辛对免疫系统会产生哪些影响,而与anti-PD-1抗体联用是否会缓解罗米地辛的对免疫系统的影响。研究方法:1.利用WST、western blotting和流式细胞术探究罗米地辛对小鼠结肠癌细胞系CT28和MC38的增殖、周期、凋亡的影响;2.流式细胞术检测罗米地辛对细胞表面MHC-Ⅰ分子表达水平的影响;3.建立小鼠结肠癌皮下移植瘤模型,通过测量肿瘤的体积和质量,研究罗米地辛对结肠癌的作用;4.RT-PCR、western blotting和流式细胞术检测罗米地辛对CT28/MC38细胞中PD-L1的表达水平的影响;5.利用western blotting、IP检测罗米地辛对组蛋白H3/H4乙酰化水平以及乙酰化位点的调节;6.使用si-RNA和sh-RNA敲降CT26/MC38中BRD4的表达水平,然后使用RT-PCR、western blotting和流式细胞术检测敲降细胞中BRD4后,细胞中PD-L1的变化;7.建立小鼠结肠癌皮下移植瘤和原位诱导结肠癌模型。待成瘤后,将小鼠随机分为四组,分别给药:1)生理盐水处理组;2)注射罗米地辛(10mg/kg);3)注射anti-PD-1抗体(300μg/只);4)注射罗米地辛(10mg/kg)+anti-PD-1抗体(300μg/只)。给药三轮后,处死小鼠,测量肿瘤的体积和质量,观察罗米地辛、anti-PD-1抗体、联合使用罗米地辛和anti-PD-1抗体的抗肿瘤效果。利用流式细胞术测量各组小鼠外周血、脾脏、骨髓、肿瘤浸润淋巴细胞中FOXP3+Treg的比例,小鼠外周血和肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+IFN-γ+T、CD4+IL4+T细胞的比例和比值的变化,CD8+IFN-γ+T比例的变化。研究结果:1.罗米地辛通过抑制AKT、MAPK、NF-κB信号通路,抑制小鼠结肠癌细胞CT28和MC38的增殖、周期,增加细胞凋亡;2.罗米地辛上调结肠癌细胞表面的MHC-Ⅰ分子;3.在小鼠结肠癌移植瘤模型中,罗米地辛抑制了结肠癌的生长;4.罗米地辛升高CT26和MC38细胞中PD-L1的表达;5.罗米地辛通过增加组蛋白H3,H4的乙酰化水平以及调节转录因子BRD4,来调控细胞表面PD-L1的表达水平;6.在结肠癌皮下移植瘤和原位诱导结肠癌小鼠中,罗米地辛升高小鼠外周血、脾脏、骨髓和肿瘤局部浸润淋巴细胞中FOXP3+Treg的比例,降低小鼠的外周血、肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+IFN-γ+T细胞的比例,Th1/Th2比值降低;同时,罗米地辛处理后,小鼠的外周血、肿瘤浸润淋巴细胞中CD8+IFN-γ+细胞比例降低。联合应用anti-PD-1抗体后,较单独使用罗米地辛组,小鼠外周血、脾脏、骨髓和肿瘤局部浸润淋巴细胞中FOXP3+Treg的比例减低,外周血、肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+IFN-γ+T细胞的比例升高,Th1/T h2比值升高,CD8+IFN-γ+细胞比例升高。结论:1.罗米地辛具有抗小鼠结肠癌的作用,其作用途径包括诱导结肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖,诱导细胞周期的G0/G1期阻滞等;2.罗米地辛上调结肠癌细胞CT26和MC38细胞表面MHC-Ⅰ分子,增强肿瘤的免疫原性;3.罗米地辛上调组蛋白H3、H4上赖氨酸残基上的乙酰化水平,促进转录因子BRD4与PD-L1启动子区的结合,升高CT26和MC38细胞中PD-L1的表达水平;4.在移植瘤小鼠和原位诱导结肠癌小鼠中,罗米地辛升高小鼠体内的FOXP3+Treg,抑制CD4+T和CD8+T细胞的活化,促使Th细胞向Th2型转化,联合应用anti-PD-1抗体上述反应会被部分逆转,即联合应用anti-PD-1抗体会增强罗米地辛的抗肿瘤效果,并且与其对Tregs和CD4+/CD8+T细胞的分化和活化调节相关。