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本论文以Bacillussubtilis芽孢为研究对象,重点研究了高压二氧化碳(high pressure CO2,HPCD)结合较低温度(60-90℃)(mild-temperature treatment,MT)(HPCD + MT)处理对B.subti is芽孢的杀灭动力学和机制,同时研究了 HPCD + MT结合nisin对B.subtilis芽孢的杀灭效果,并对杀灭机制进行了探究,为HPCD + MT在食品杀菌中的应用提供了理论基础。具体研究内容和结果如下:(1)研究了 HPCD + MT处理中的温度、压力、酸效应和CO2的分子效应对B.subtilis芽孢的杀灭效果,以及HPCD + MT在不同温度压力条件下对B.subtilis芽孢的杀灭效果和动力学。试验中选取HPCD + MT处理压力为6.5-25 MPa,温度为44-91℃,时间为0-120min,同时以0.1 MPa下82-91℃热处理作为对比。试验测定了 HPCD + MT处理过程中芽孢存活率、吡啶-2,6-二羧酸(dipicolinic acid,DPA)的释放和芽孢的粒度变化。研究结果表明HPCD + MT对芽孢的杀灭作用是温度、压力、酸效应和CO2分子效应综合作用的结果,而不是某一种效应单独作用的结果。通过对比HPCD + MT和热处理对芽孢的杀灭效果发现,相同温度下HPCD + MT处理比热处理能更有效的杀灭芽孢。HPCD + MT对芽孢的杀灭效果随着压力、温度的升高,或时间的延长而提高,然而当压力高于15MPa时,杀灭效果反而下降,出现了保护效应。HPCD + MT对芽孢的杀灭动力学曲线根据处理压力的不同表现为两种类型:(i)压力为6.5和10 MPa时,曲线为两段式,包括延滞期和快速杀菌期;(ii)压力为15-25 MPa时,曲线为三段式,包括延滞期、快速杀菌期和拖尾期,拖尾期再次表明芽孢在HPCD + MT处理过程中出现了保护效应。对芽孢粒度研究发现,HPCD + MT处理过程中芽孢发生聚集,通过添加0.1%的表面活性剂Tween80可以有效降低芽孢的聚集程度,同时提高HPCD + MT对芽孢的杀灭效果,这表明HPCD + MT处理过程中的保护效应是由芽孢的聚集导致。对DPA研究发现,HPCD + MT处理过程中芽孢的死亡伴随着大量DPA的释放,这表明HPCD + MT处理过程中芽孢发生了萌发或芽孢内膜被破坏。(2)研究了 HPCD + MT处理过程中B.subtilis芽孢的萌发和结构的破坏。试验选取HPCD +MT处理条件为6.5-20MPa,64-86℃,0-60min,同时以0.1MPa下86℃热处理作为对比。试验测定了 HPCD + MT处理过程中芽孢热抗性损失、DPA释放、芽孢皮层和内膜透性的变化,并观察了芽孢外部形态和内部结构的变化。研究发现HPCD + MT处理后的芽孢热抗性没有损失,同时HPCD + MT处理过程中DPA的释放速率总是低于芽孢的杀灭速率,表明HPCD + MT处理过程中芽孢没有发生萌发。流式分析结果表明HPCD + MT处理后芽孢的皮层和芽孢内膜透性增加,而HPCD + MT处理过程中芽孢的死亡伴随着大量DPA的释放,同时HPCD + MT处理后的大量芽孢被PI染色,进一步证实芽孢内膜透性增加。扫描电镜结果显示HPCD + MT处理后芽孢表面出现褶皱、凹陷、破损甚至破裂,透射电镜结果显示HPCD + MT处理后芽孢的芽孢衣、皮层、芽孢内膜和芽孢核出现不同程度的破坏。上述研究结果表明HPCD + MT处理不是通过诱导芽孢萌发,而是通过破坏芽孢结构杀灭芽孢。(3)研究了 HPCD + MT处理对B.subtilis芽孢不同结构的破坏,并对导致芽孢死亡的关键事件进行深入探究。试验选取HPCD + MT处理压力为20 MPa,温度为84-86℃,时间为0-60 min,同时以0.1 MPa下86℃热处理作为对比。试验测定HPCD + MT处理后芽孢衣、芽孢内膜、芽孢核内蛋白和DNA的破坏,以及芽孢的萌发和生长特性。对HPCD + MT处理的芽孢进行密度梯度离心分离,得到的芽孢存活率仅为0.17%,而DPA含量高达97.9%,即一部分被HPCD + MT杀灭的芽孢保留了 DPA,表明HPCD + MT处理不是通过使芽孢内膜破裂杀灭芽孢。后续将对HPCD + MT处理后死亡但保留了 DPA的芽孢进行研究。对萌发特性的研究结果显示,HPCD +MT处理后芽孢在L-valine或AGFK诱导下仍能够萌发,且最大萌发率远高于芽孢存活率,表明一部分死亡的芽孢也能萌发,因此HPCD + MT不是通过破坏芽孢内膜上萌发受体蛋白GerA、GerB或GerK杀灭芽孢。需要注意的是,在十二烷胺(dodecylamine,DDA)的诱导下HPCD + MT处理后芽孢的萌发速率反而升高,这一方面表明HPCD + MT对DPA释放通道蛋白SpoVA没有破坏,另一方面也表明HPCD + MT的作用加快了 DDA与SpoVA蛋白的作用。进一步研究表明,这种DDA诱导的芽孢萌发速率的升高是由于HPCD + MT破坏了芽孢衣,加快了 DDA进入芽孢内膜与SpoVA蛋白作用导致。对芽孢核内蛋白研究结果显示,HPCD + MT处理破坏了芽孢核内的GFP蛋白,但破坏程度要远低于芽孢的杀灭率,这表明HPCD + MT不是通过破坏芽孢核内蛋白杀灭芽孢。对芽孢DNA的研究结果显示,HPCD + MT处理后芽孢中没有出现突变菌体,表明HPCD + MT不是通过破坏DNA杀灭芽孢。对芽孢内膜特性研究结果显示,HPCD + MT处理后芽孢对高渗环境抗性和对DPA的维持能力下降,并且萌发后均能被PI染色,而对芽孢生长特性研究结果显示,芽孢萌发后生长过程受阻。上述结果表明HPCD + MT处理对芽孢内膜造成损伤,导致芽孢萌发后不能正常生长而被杀灭。(4)研究了 HPCD + MT结合nisin对B.subtilis芽孢的杀灭效果和机制。试验选取HPCD +MT处理条件为6.5或20MPa,84-86℃,0-30min,nisin处理浓度为0.02%。处理方式包括HPCD+ MT 结合 nisin(HPCD + MT + nisin)、先 HPCD + MT 处理后 nisin 处理(HPCD + MT→nisin)、先nisin处理后HPCD处理(nisin→HPCD + MT)。试验测定了 HPCD + MT + nisin处理后芽孢存活率、芽孢内膜的透性和芽孢结构的破坏。研究结果显示HPCD + nisin对芽孢具有协同杀灭效果,且杀灭效果HPCD + MT +nisin高于HPCD+MT→nisin或nisin→HPCD+MT。对DPA研究显示HPCD + MT + nisin处理提高了芽孢DPA释放速率,流失分析结果显示HPCD + MT + nisin处理提高了芽孢被PI染色的比例,上述结果表明,与单独HPCD + MT处理相比,HPCD + MT +nisin处理对芽孢内膜的破坏作用增加。综上,HPCD + MT + nisin对芽孢的杀灭机制如下:HPCD+ MT破坏了芽孢结构,nisin进入芽孢内部作用于芽孢内膜,提高了对芽孢内膜的损伤,导致更高的杀灭速率。