多酶级联催化在生物医药中具有重要的应用价值,利用多酶共固定化技术可提高其重复使用性,而传统共固定化方法对多酶的固定存在随机性,导致级联效率较低。DNA定向固定化技术（DDI,DNA directed immobilization）是近年来兴起的一种利用DNA自组装实现多酶共固定化的技术,其原理是通过DNA碱基互补配对将酶定向固定至载体表面,从而提高多酶级联活性。本实验以环氧基修饰的聚乙酸乙烯酯（PVAC）磁性微球为载体,利用DDI技术将葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根过氧化物酶（HRP）通过DNA“星形”支架定向共固定至磁性微球表面,制备出磁性GOD/HRP-DNA@PVAC多酶共固定化体系。DNA“星形”支架可调控双酶间距,从而对磁性多酶共固定化体系进行优化。主要内容包括以下几个部分:第一,环氧基修饰功能化磁性微球的制备。以油酸包覆的Fe3O4磁粒子为核,以乙酸乙烯酯（VAC）为单体,通过聚合反应制备出PVAC磁性微球并对其进行酯解,采用显微镜、粒径分布及热失重等技术对其进行表征,结果显示制备的PVAC磁性微球磁响应性和再分散性良好,酯解前后PVAC磁性微球粒径分布均匀;然后对制备出的PVAC磁性微球进行环氧基修饰,并对其进行红外表征,通过实验测得其上环氧基含量为1067μmol/g,可作为多酶共固定化体系载体。第二,磁性DNA“星形”支架定向共固定化多酶体系的制备及优化。首先,以环氧基修饰的PVAC磁性微球为载体,设计了一组具有合适链长的DNA单链Y1、Y2和Y3（初始组）,利用其分别偶联环氧基修饰的PVAC磁性微球、GOD和HRP制得Y1@PVAC磁性微球、GOD-Y2复合物和HRP-Y3复合物,并通过红外光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行表征。然后,采用DDI技术将GOD-Y2复合物和HRP-Y3复合物共固定至Y1@PVAC磁性微球表面制备出磁性GOD/HRP-DNA@PVAC多酶共固定化体系,并通过红外、热失重、荧光、荧光共振能量转移等技术对其进行表征。之后对其固载量和级联活性进行测定,并与传统随机共固定化方法（共吸附、共偶联等）进行比较,结果显示其级联活性具有明显优势。采用红外光谱对固定化酶的蛋白二级结构进行解析,结果显示采用DDI技术进行固定对酶的二级结构影响较小,能较好地保持其活性。实验进一步设计了两组不同链长的DNA（加长组和缩短组）分别进行磁性GOD/HRP-DNA@PVAC多酶共固定化体系的制备,通过调节DNA链长对体系进行优化,结果显示采用初始组DNA（三条DNA链长均为30个碱基,酶间距为10.08 nm）制备的磁性GOD/HRP-DNA@PVAC多酶共固定化体系级联活性最高。第三,对磁性DNA“星形”支架定向共固定化多酶体系的性能及动力学参数进行考察。实验测得其最适p H为5.0,较游离酶（7.0）低,最适温度为35℃,与游离酶相同;且磁性GOD/HRP-DNA@PVAC多酶共固定化体系具有更宽的温度和p H适应范围,更好的酸碱稳定性、热稳定性、放置稳定性、可逆性、重复使用性以及更高的催化效率和动力学性质。本实验采用三条单端修饰的DNA单链两两部分互补配对形成“星形”支架,进行多酶共固定化体系的制备。DNA作为一种生物材料,利用其作为支架进行多酶共固定化体系的制备,不仅可精准调控酶的位置,而且对酶的空间结构影响较小,可以最大程度的保留其活性;同时该DNA“星形”支架具有一定刚性,可较好的维持双酶间的酶间距,且通过调节DNA单链的长度可对酶间距进行调控,实现酶间距可调的动态多酶共固定化体系构建。与文献报道的采用结构设计复杂的DNA折纸术对酶间距进行调控相比,本试验所设计的DNA“星”形支架仅采用三条DNA单链,结构简单,制备方便,大大降低了制备成本。