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研究背景肾小管上皮细胞－间充质细胞转分化（Epithelial-mesenchymaltransition EMT）是肾间质纤维化发生发展的核心环节。研究发现肾小管EMT是可逆的过程，在EMT早期给予干预可以阻止EMT的发生，对延缓肾脏纤维化、保护肾脏残余肾功能具有非常重要的意义。MicroRNA（miRNA）是近年发现的的一类高度保守的、内源性非蛋白编码的长度约为20-22nt的小分子RNA，参与很多疾病的发生。研究表明，部分miRNA参与了肾间质纤维化的发生发展。中药丹酚酸B是从植物丹参Salvia Miltiorrhiza Bge的根及根茎中提取的一种药物。研究表明丹酚酸B具有抗氧化、抗肝纤维化和心血管保护等作用，近期有文献报道丹酚酸B亦具有良好的肾保护作用。同时，通过研究我们发现丹酚酸B可以改善肾间质纤维化。目前关于丹酚酸B对肾间质纤维化的改善作用及其调控机制研究甚少。我们推测丹酚酸B可能通过阻止肾小管EMT的发生并影响相关miRNA的改变而发挥对肾脏的保护作用。为此本研究从细胞形态学、α-SMA以及E-Cadherin的表达变化方面研究丹酚酸B对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的阻止作用，制作miRNA芯片并从中筛选出与HK-2细胞EMT可能有关的miRNA，同时对相关miRNA的下游基因做进一步研究。我们希望通过本项工作可以明确丹酚酸B对肾小管EMT的阻止作用，同时为防治肾间质纤维化提供一定的理论和实验依据。研究方法一、观察丹酚酸B对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的阻止作用。1.实验分组：①对照组：未加入丹酚酸B或者TGF-β1；②TGF-β1组：在细胞培养基中加入TGF-β1（浓度为5ng/ml）；③丹酚酸B＋TGF-β1组：在细胞培养基中分别加入丹酚酸B和TGF-β1(浓度为5ng/ml)，丹酚酸B的浓度分别为0.1μmol/L，1μmol/L，10μmol/L，100μmol/L。细胞加入药物后培养48h。2. MTT法观察不同浓度丹酚酸B（0.1、1、10、100uM）对TGF-β1诱导的HK-2细胞的活力的影响。3.倒置相差显微镜观察不同浓度丹酚酸B对TGF-β1诱导的细胞形态学改变。4. RT-PCR检测不同浓度丹酚酸B组中α-SMA和E-Cadherin的mRNA的表达。5.免疫荧光检测观察不同浓度丹酚酸B组中α-SMA以及E-Cadherin蛋白荧光强度的表达。二、制作miRNA芯片、筛选并验证miRNA的表达以及检测miR-106b调控基因TGF-βRⅡ的表达变化1.制作miRNA芯片，筛选有显著性表达差异的miRNA。2. RT-PCR验证miR-93、miR-106b、miR-34a和miR-493*的表达。3.脂质体瞬时转染法转染miR-106b mimic。实验分为3组：①正常对照组，②TGF-β1(5ng/ml）+N.C.(80nM)组，③TGF-β1（5ng/ml）+miR-106b mimic(80nM)组。4.半定量RT-PCR、Western Blotting检测TGF-βRⅡ mRNA和蛋白的表达。研究结果一、丹酚酸B对TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT的阻止作用1. MTT结果与正常组比较，不同浓度丹酚酸B对正常细胞以及TGF-β1诱导的HK-2细胞的活力均没有明显差异，在大剂量丹酚酸B(100uM)情况下细胞活力甚至有所升高。2.丹酚酸B对HK-2细胞形态的改变正常HK-2细胞呈现鹅卵石或铺路石样形态，TGF-β1诱导HK-2细胞48h后细胞呈细长的梭状，表现为纤维状细胞外观。丹酚酸B呈浓度依赖性阻止细胞纤维状改变，浓度越大，阻止作用越明显。3. RT-PCR结果与正常组细胞比较，TGF-β1组细胞中α-SMA表达量显著上调(p<0.001),E-Cadherin表达量显著下调(p<0.001)；与TGF-β1组比较，丹酚酸B组呈浓度依赖性下调α-SMA表达(P<0.05)，上调E-Cadherin的表达(P<0.05)。4.免疫荧光结果正常细胞中微弱表达α-SMA蛋白，正常表达E-Cadherin蛋白；TGF-β1组α-SMA蛋白显著增强，E-Cadherin蛋白显著降低；丹酚酸B100uM组明显降低α-SMA表达和提高E-Cadherin表达，丹酚酸B1uM组作用不明显。二、miRNA的筛选和表达验证，检测TGF-βRⅡmRNA和蛋白的变化1.筛选有显著性表达差异的miRNA以差异倍数（Fold Change）>2.0或者<0.5为标准，筛选出在丹酚酸B阻止HK-2细胞EMT过程中出现显著性差异表达的miRNA51条，其中42条下调，9条上调。2. RT-PCR验证具有显著性表达差异的miRNART-PCR结果显示：miR-93，miR-106b和miR-34a在TGF-β1诱导EMT组均显著下调，而在丹酚酸B组呈上调趋势(P<0.05)；miR-493*在TGF-β1诱导EMT组显著上调，而在丹酚酸B组呈下调趋势(P<0.05)；RT-PCR结果与芯片变化趋势相符。3. miR-106b的调控基因TGF-βRⅡ的表达变化(RT-PCR、Western Blotting)过表达miR-106b下调TGF-βRⅡmRNA和蛋白的表达。转染miR-106bmimic组TGF-βRⅡmRNA的表达较TGFβ1+N.C.组表达量显著下调(P<0.05)，western blotting检测蛋白结果显示，转染组同TGFβ1+N.C.组相比蛋白表达显著下降(P<0.05)。研究结论丹酚酸B可以阻止TGF-β1诱导的HK-2细胞EMT，且阻止过程伴有明显的miRNA表达变化，部分miRNA的改变与丹酚酸B阻止HK-2细胞EMT密切相关。