【摘 要】
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目的:构建人血管内皮生长因子 165(Vascular endothelial growthfactor 165,VEGF165)原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。构建VEGF165 真核表达载体并将其转入人慢性髓系白
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目的:构建人血管内皮生长因子 165(Vascular endothelial growthfactor 165,VEGF165)原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。构建VEGF165 真核表达载体并将其转入人慢性髓系白血病急变细胞株K562 中,研究其对 K562 增殖和凋亡的影响,进一步验证 VEGF165通过自分泌途径对肿瘤生长发挥作用,从而为临床上恶性血液病抗血管新生治疗的部分机理提供实验依据。 方法:用 RT-PCR 法从人白血病细胞株 TF1 扩增 VEGF165 完整编码序列(不包含前面 81bp 的信号肽序列及终止密码子),将其插入质粒pUCmT中并测序鉴定。将测序正确的pUCmT-VEGF165与PET20b(+)均用 EcoRI 和 SalI 双酶切,回收纯化目的基因片段与表达载体,构建VEGF165 的 原 核 表 达 载 体 PET20b-VEGF165, 转 化 大 肠 杆 菌BL21(DE3)pLysS,IPTG 诱导表达,表达产物用 Ni-NTA Resin 纯化,SDS-PAGE 及 Western Blot 鉴定重组蛋白。用 RT-PCR 法从人白血病细胞株 HL60 扩增 VEGF165 完整编码序列, 将其插入质粒 pUCmT 中并测序鉴定。将测序正确的 pUCmT-VEGF165 与 pcDNA3.1(-)均用 EcoR I和 HindⅢ双酶切,回收纯化目的基因片段与表达载体,构建 VEGF165的真核表达载体 pcDNA3.1-VEGF165。用脂质体介导的方法转染人慢性髓系白血病急变细胞株 K562,G418 筛选转染阳性的细胞株。RT-PCR和Western Blot检测VEGF165在RNA水平和蛋白水平的表达。用MTT
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