目的：　　细菌耐药已经成为威胁人类健康的严重公共卫生问题，尤其是对多种抗生素耐药的“超级细菌”的出现，及其在全世界范围内的播散，使耐药细菌感染成为临床抗感染治疗中极为棘手的问题。由于这些“超级细菌”对多种抗生素耐药，可供治疗选择的抗生素十分有限，而且临床上尚无特异性治疗药物，感染后患者死亡率很高，因此，“超级细菌”感染被列为世界上最难治疗感染性疾患。面对“超级细菌”种类日趋增多和迅速蔓延，以及感染后致死率继续攀高的严峻形势，如何有效控制“超级细菌”感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点，寻找和研制有效控制“超级细菌”感染的新策略和新药物，已成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。　　经典的抗生素研发重要策略之一是从已有各种类别抗生素中研发新的衍生物。伴随着抗生素的广泛应用，越来越多的细菌对现有抗生素产生交叉耐药，采用结构修饰和改造研发新型抗生素受到限制，抗生素研发速度明显减慢。而且新型抗生素应用于临床后，并不能从根本上避免细菌产生耐药性，细菌很快会对这些抗生素产生新的耐药性。而且抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了研发新抗生素的速度，特别是多药耐药的“超级细菌”成为未来细菌耐药新趋势。　　为了有效对抗日益严重的超级耐药细菌，必须寻找新的突破口。反义抗菌剂突破以细菌蛋白为靶点的经典研究思路，根据细菌体内基因组学相关信息，以细菌体内增值、致病性、耐药相关基因为靶点，从阻断相关基因的表达入手，进而达到抑制或杀灭细菌的作用，因而被认为是被对抗耐药细菌的新策略和突破口。尽管已有的研究已经证实反义抗菌剂在抑制细菌靶基因方面显示出可靠的靶基因抑制效果，良好的抗菌作用。但是仍有2个主要问题制约其向应用的研发，其一，靶基因抑制过分专一，目前几乎所有反义抗菌的研究主要集中在针对单一菌株的单一基因，因此仅对特定菌株产生作用，无法实现广谱抗菌作用，进而限制其临床应用的潜在可能；其二，细胞摄入率低，反义分子的分子量较大，裸分子摄取进入细菌细胞内的量极低。　　针对上述问题，本课题确定以下2个研究目标：?寻找具有作为广谱反义抗菌剂潜在靶点的靶基因，并确定其有效性；?研究促进反义分子进入细菌的递药策略。基于上述目标，我们以当前临床感染中最常见、耐药发生率和耐药强度最高的六种革兰氏阴性致病菌,包括大肠埃希氏杆菌（Escherichiacoli,E.coli），肠炎沙门氏菌（Salmonellaenterica,SE）、肺炎克雷伯杆菌铜（Klebsiellapneumoniae,KP）、弗氏志贺菌（Shigellaflexneri,SF）、鲍曼氏不动杆菌（Acinetobacterbaumanni,AB）及铜绿假单孢菌（Pseudomonasaeruginosa,PA）为研究对象，以上述细菌体内共有的编码RNA聚合酶?70因子的基因rpoD为靶点，设计并合成抗rpoD的肽核酸，将其与透膜肽（CPP）共价连接制备成反义抗rpoD因子肽核酸（anti-rpoDpPNA），在体外观察其抗菌谱、抗菌活性、稳定性，及其是否诱导细菌耐药等效应，在体内观察anti-rpoDpPNA对感染动物的保护效应。同时，与最先报道携带NDM-1耐药基因超级细菌的实验室合作，证实anti-rpoDpPNA抗超级细菌的有效性。　　方法：　　1.anti-rpoDpPNA的设计与合成　　根据大肠埃希菌（E.coli），肠炎沙门氏菌（SE）、肺炎克雷伯杆菌铜（KP）、弗氏志贺菌（SF）、鲍曼氏不动杆菌（AB）和铜绿假单孢菌（PA）六种革兰氏阴性细菌编码RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的序列，采用BLAST软件比对其序列确定同源区域，并依据RNAstructure4.6软件预测rpoDRNA二级结构，确定反义结合可能靶序列，综合多项参数（主要为结合能量参数、PNA解链温度和靶RNA二级结构）优化设计抗rpoD的反义肽核酸（PNA），采用Fmoc方法在固相载体上自动合成抗rpoD反义PNA（anti-rpoDpPNA）以及作为对照的裸PNA、裸透膜肽（CPP）和错配PNA-CPP结合物（mismatchedanti-rpoDpPNA），采用RP-HPLC对样品进行分离纯化，MALDI-TOF测定纯化后样品的分子量。　　2.anti-rpoDpPNA反义靶位有效性的体外筛选及最优anti-rpoDpPNA的体外药效学评价与稳定性研究　　选择上述六种致病细菌的敏感菌株和多药耐药菌株为研究对象，以最低抑菌浓度（MIC）、细菌生长曲线、菌落形成单位（CFU）计数作为评价指标，对制备的系列anti-rpoDpPNA的抗菌活性和抗菌谱进行评价，筛选出具有最优抗菌活性和最广抗菌谱的anti-rpoDpPNA，确定rpoD最敏感的反义抑制靶序列位置。　　首次在《新英格兰医学杂志》和《柳叶刀-传染病》对超级细菌耐药基因NDM-1进行报道的Nordmann教授和Livemore教授的研究团队，选取携带NDM-1基因的人类致病革兰氏阴性细菌，主要包括大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼氏不动杆菌、阴沟肠杆菌（Enterobacterdoacae）和弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundii），测定我们筛选到的最优anti-rpoDpPNA各菌的MIC和MBC。　　我们采用RT-PCR和WesternBlot方法，检测最优anti-rpoDpPNA对上述六种致病细菌rpoDmRNA和蛋白质表达水平的影响，确证其反义抗菌作用的靶位特异性。进一步采用RT-PCR方法检测最优anti-rpoDpPNA对受大肠埃希菌rpoD调控的下游多个重要致病基因，包括seqA、ftsZ、mazF、prfB、rpoS、tufB和ygjD表达的影响，揭示最优anti-rpoDpPNA抗菌作用机制。　　将最优anti-rpoDpPNA与大鼠血浆共孵育，电泳法观察anti-rpoDpPNA在大鼠血浆中的稳定性；采用测定药物对连续多代培养细菌MIC变化的方法，评估anti-rpoDpPNA诱导ESBLs-EC产生耐药性的情况；建立人胃粘膜上皮细胞与单一（E.coliMG1655）或多种细菌（EC、SE和PA）共培养的感染模型，分别观察不同浓度最优anti-rpoDpPNA的广谱杀菌作用及其对细胞的保护作用。　　3.最优anti-rpoDpPNA体内抗菌药效学体内抗菌药效学研究　　建立BALB/c小鼠的ESBLs-EC和MDR-SF脓毒血症模型，观察不同浓度anti-rpoDpPNA对BALB/c感染小鼠生存时间、存活率的影响；取感染小鼠的肝、脾、肺、肾，匀浆后将稀释菌液涂布于MH琼脂培养基，观察脏器中细菌菌落计数，以及最优anti-rpoDpPNA对上述脏器内ESBLs-EC和MDR-SF生长影响；取感染小鼠肝、脾、肺、肾组织，HE染色，观察最优anti-rpoDPNA-CPP对感染组织形态学的影响。　　结果：　　1.anti-rpoDpPNA的优化设计、合成与靶位筛选　　应用BLAST软件对大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌、弗氏志贺菌、鲍曼氏不动杆菌和铜绿假单孢菌等六种革兰氏阴性细菌编码RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的序列进行同源性分析，结果显示，上述细菌rpoD1.1区域的序列共享碱基序列最多，其中大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯杆菌和弗氏志贺菌此区域序列相似性高达98％，可以作为广谱反义PNA的靶基因部位。　　RNAstructure软件对rpoDmRNA1.1区域分析的结果显示，该区域无明显的稳定双链结构，同时，采用12个碱基（最优长度/效价比）为PNA设计的基本长度，结合Oligowalk和PNA的Tm软件预测的参数，选取该区域的1-11、2-13、3-14、11-22、58-69位碱基序列作为合适的反义PNA靶序列，并根据这些区域的核酸序列，分别设计并合成了5条与这些基因序列互补的抗rpoD反义PNA（anti-rpoDPNA），并分别在碳末端将其与促进PNA通过细胞壁的透膜肽(KFF)3K相连接，制备成抗rpoD的肽核酸-透膜肽接合物（anti-rpoDpPNAs）。采用RP-HPLC纯化样品，MALDI-TOF测定所有合成anti-rpoDpPNAs的实际分子量与理论分子量相符，纯度大于90％。然后，在4株包括敏感和耐药的大肠埃希菌上检测anti-rpoDpPNA的抑菌活性，结果发现，作用于rpoDmRNA1-11和2-13序列区域的anti-rpoD-PNA-CPPs显示良好的抑菌效果，其MIC值在25?M。该结果提示，基因rpoD的mRNA起始编码子区域为PNA反义抑制作用的敏感部位，同时提示anti-rpoDpPNA对起始编码子AUG的反义抑制是其发挥抑菌作用所必须的。　　为了进一步增强anti-rpoD-PNA的反义抗菌效果与透膜效率，我们对作用于rpoDmRNA1-12序列区的anti-rpoDpPNA进行了优化设计，主要包括在PNA与CPP间加入甘氨酸，将CPP与anti-rpoDPNA氮端相连接，将anti-rpoDPNA碳末端2个核苷酸截去形成截短体，anti-rpoDPNA结合靶序列负向移位，以及将透膜肽(RXR)4XB与anti-rpoDPNA氮末端相连接等。结果发现分别与(RXR)4XB和(KFF)3K连接的具有相同反义PNA序列，即anti-rpoDPNA01的截短体的PNA0106和PNA0103显示出良好的广谱抑菌效果。anti-rpoDpPNA0106抑制敏感和多药耐药大肠埃希菌的MIC浓度为5～25?M，抑制多药耐药鲍曼不动杆菌、多药耐药弗氏志贺菌、多药耐药肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌和产超广谱?-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC浓度分别为1.25、2.5、12.5、12.5和30?M。anti-rpoDpPNA0103抑制敏感和多药耐药大肠埃希菌的MIC浓度为6.25～25?M，抑制多药耐药鲍曼不动杆菌、多药耐药弗氏志贺菌、多药耐药肠炎沙门氏菌、铜绿假单胞菌和产超广谱?-内酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC浓度分别为2.5、5、>25和40?M。　　上述结果表明，rpoDmRNA可以作为广谱反义抗菌的靶基因，该基因1.1区域内的第1-10编码区序列为理想的反义抗菌靶序列区，筛选获得的反义PNA0103和PNA0106对多种革兰氏阴性耐药致病菌具有抑制作用，其抑菌效果较强。　　2.anti-rpoDpPNA递药体系的筛选　　为了进一步比较何种透膜肽能够更有效地将PNA递送至细菌内，我们观察anti-rpoDpPNA0103和0106在多种细菌上的抑菌效果，结果显示，二者均能够分别浓度依赖性抑制敏感和耐药的大肠埃希菌、多药耐药鲍曼不动杆菌、产超广谱?-内酰胺酶肺炎克雷伯菌、多药耐药弗氏志贺菌、多药耐药肠炎沙门氏菌在MH培养液中的生长，抑制MH琼脂培养基上的菌落形成，且在高浓度时显示杀菌作用。