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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、炎症、系统性的自身免疫性疾病。T细胞在RA的病理机制及病程进展中起重要作用,T淋巴细胞的主要亚群,辅助性T细胞1(Helper T cell 1, Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)因其具有介导炎症、细胞生长和激活的生物学功能,在RA的病程中发挥着极其重要的作用。由于RA的发病原因和病理机制还远未被阐述清楚,目前还没有令人满意的疗法。有文献报道动物关节蛋白类,特别是II型胶原蛋白(type II collagen, CII),在T细胞介导的免疫反应中起关键作用,鸡II型胶原(chicken type II collagen, CCII)是一类由鸡胸部软骨提取出来的蛋白,这类蛋白可以诱导自身免疫性疾病的免疫耐受从而达到治疗作用。Trentham首先报道了CII治疗28例RA患者(均未服免疫抑制剂)的随机对照临床研究,发现口服CII后,患者的关节肿胀指数和压痛指数、15m行走时间的改善程度明显优于安慰剂组。本课题组的早期研究发现:CCII对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)具有免疫调节作用,可以降低淋巴细胞的增殖反应、降低炎性细胞因子IL-2的水平并降低腹腔巨噬细胞分泌IL-1的功能,从而改善大鼠AA症状。进而本课题组分别在包含236名受试者和503名受试者的II期和III期的CCII临床试验中得出,与甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)组比较,CCII有治疗RA的效果,且不良反应要明显低于MTX组。本实验基于本课题组以往的研究,以肠系膜淋巴结淋巴细胞(mesentric lymph node lymphocytes,MLNLs)为研究对象,研究CCII如何诱导和调节T淋巴细胞亚群的免疫平衡和相关作用。目的:根据CCII对CIA大鼠的足爪肿胀、评分、关节滑膜和肠系膜淋巴结病理形态学的改善作用,观察CCII对CIA大鼠MLNLs的IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平的影响;分析关节肿胀度与细胞因子IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平的相关性;在整体、器官、细胞水平上,研究CCII对大鼠CIA的作用。以本课题组以往的研究为基础,以CIA发病的免疫细胞MLNLs为研究突破口,研究抗、促炎性细胞及细胞因子在CIA发病中的可能机制,进一步研究CCII对CIA大鼠MLNcs中主要T细胞亚群的免疫调节作用。方法:大鼠足跖、尾根部、背部皮内多点注射鸡II型胶原(chicken type II collagen, CCII)乳剂制备CIA模型,致炎后眼眶取血检测II型胶原抗体,将大鼠分为5组:正常组(II型胶原抗体阴性);模型组(II型胶原抗体阳性);CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)剂量组(II型胶原抗体阳性)。CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)灌胃给药(intragastric administration, ig)(d14-d21)。足容积法测量继发侧足肿胀、进行多发性关节评分;光学显微镜观察关节滑膜及肠系膜淋巴结的病理变化;活化小鼠脾细胞增殖法检测IL-2水平;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测大鼠MLNcs的IL-4、IL-17和TGF-β的水平;用流式细胞技术分析MLNcs中CD4+CD25+Treg和Th17细胞的比例。结果:1. CCII缓解CIA大鼠关节肿胀、降低关节评分、改善肠系膜淋巴结和关节滑膜的组织的炎症CIA大鼠免疫注射后26天左右炎症反应达到高峰,光镜下可见滑膜组织中滑膜细胞增生明显、层次增多、排列紊乱,滑膜下层纤维组织增生,血管扩张、充血,炎性细胞浸润;肠系膜淋巴结中副皮质区明显扩大;髓质内炎性细胞浸润;淋巴结呈特异性滤泡增生。CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)治疗给药(ig, d18-d25)可明显抑制CIA大鼠的关节肿胀,降低多发性关节炎指数,改善CIA大鼠关节滑膜和肠系膜淋巴结炎症和病理变化。2. CCII抑制炎性细胞因子IL-2和IL-17的分泌,升高抗炎因子IL-4和TGF-β水平,诱导细胞的免疫平衡CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)治疗给药(ig, d18-d25)可降低CIA大鼠过高的IL-2和IL-17水平,上调CIA大鼠MLNLs分泌的过低的IL-4和TGF-β水平,并且流式分析结果表明了CIA大鼠的肠系膜淋巴结中Th17细胞的比例比正常大鼠高,而Treg细胞要比正常大鼠比例低,这说明了CIA大鼠肠系膜淋巴结中炎性细胞大量活化增殖,抗炎细胞被抑制,CCII治疗给药可以降低Th17细胞在CIA大鼠肠系膜淋巴结的活化增殖。CCII抑制了CIA大鼠MLNLs分泌IL-2和IL-17,促进了CIA大鼠MLNLs分泌IL-4和TGF-β,诱导了Th1/Th2和Th17/Treg的免疫平衡。结论:1. CCII治疗给药可明显抑制CIA大鼠的关节肿胀,改善CIA大鼠关节滑膜和肠系膜淋巴结炎症和病理变化,不同程度地下调MLNLs分泌的炎性细胞因子IL-2和IL-17水平,上调抗炎细胞因子IL-4和TGF-β水平。相关性分析显示,CCII缓解CIA大鼠关节肿胀与肠系膜淋巴结的炎症,与其降低MLNLs分泌的炎性细胞因子IL-2和IL-17水平、升高抗炎细胞因子IL-4和TGF-β水平密切相关。2. CCII治疗给药降低CIA大鼠过高的IL-2和IL-17水平,上调CIA大鼠MLNLs分泌IL-4和TGF-β的水平,使被抑制的抗炎细胞重新活化,抑制促炎细胞的增殖,诱导Th1/Th2和Th17/Treg的免疫平衡,是CCII发挥治疗作用的重要机制。