雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)为卫矛科植物雷公藤根的木质部。同属的植物还有昆明山海棠(Tripterygium Hypoglaucum(Levl.)Hukeda.),以及苍山雷公藤(Tripterygium Forretii Dials.)、东北雷公藤(Tripterygium Regelli Sprague et Takeda.)等。雷公藤是应用历史悠久的常用中草药,现代临床研究表明雷公藤及其制剂具有抗炎、免疫抑制、抗生育等活性,特别是对于与自身免疫相关的类风湿性关节炎、肾小球肾炎、红斑狼疮、肾病综合症等目前临床缺乏治疗手段的多种疑难病证疗效显著。近年来,对雷公藤的基础研究主要集中在雷公藤多苷,雷公藤甲素等雷公藤的制剂及成分的药理作用和毒性方面,而雷公藤成分复杂,因此其中具有毒性作用的物质远不止这些。目前已经从雷公藤属植物中分离出三百多种活性物质,对于各类成分的毒性大小却看法不一。肾脏作为机体的主要排泄器官,容易受到毒性物质的损伤,有研究表明:雷公藤中毒死亡病例中肾损害发生率达54%,因肾功能衰竭致死的死亡率达38%,但是由于雷公藤的成分和肾损伤发病机制的复杂,目前国内外对其肾毒性成分尚未有明确完整的研究。本实验通过提取分离雷公藤的不同部位对实验动物进行灌胃给药,首先明确雷公藤部位的肾损伤作用,而后再以这些毒性部位为重点,进一步探讨了雷公藤造成肾损伤的作用机制,这将有助于雷公藤肾毒性成分和增效减毒制剂的研究,保证雷公藤及其制剂在临床的安全有效应用。本研究主要包括以下几部分内容:1.毒性部位的确定。提取分离雷公藤不同部位,给小鼠进行长期灌胃给药,小鼠按体重随机分成9组,分别为:空白对照组;水提物高、低剂量组;醇提物高、低剂量组;乙酸乙酯高、低剂量组和正丁醇高、低剂量组。低剂量灌以临床等效量(3.25g/kg),高剂量灌以临床等效量的5倍量(16.25g/kg)。空白对照组给予等体积生理盐水。实验动物分别给药一周、二周、三周和四周。检测给药后小鼠血清中BUN、Scr、LDH、TP和ALB的含量。肾脏用于组织病理学检查。结果显示,雷公藤不同部位给药一周还未对小鼠肾脏产生损伤作用。但是给药两周后,血清中BUN、Scr和LDH的浓度显著升高,TP和ALB的浓度显著降低,其中以醇提物部位,乙酸乙酯部位和正丁醇部位的变化最为明显。水提物部位的各项指标虽然没有显著性变化,和空白组相比,水提物部位的BUN、Scr和LDH的浓度有一定的增加,并且TP和ALB的浓度也呈现出降低的趋势。醇提物部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位的四周病理组织学检查可见肾小管细胞不同程度的核固缩,给药两周开始出现肾小管上皮细胞水肿。上述变化随给药剂量和给药时间的增加而逐渐加重。该实验说明:雷公藤给药两周开始出现明显的肾脏损伤。其各提取部位对小鼠的肾脏均有毒性,其中以醇提物部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对肾脏的毒性较大。2.毒性部位的肾损伤机制探讨。取肾毒性损伤较大的给药部位的肾脏组织,免疫组化法检测肾组织中AngⅡ(血管紧张素2),caspase-3(半胱氨酸酶3),GSH(谷胱甘肽)和TLR-4(Toll样受体4)含量的变化;Western Bolt方法分析KIM-1(肾损伤分子-1)和ROS(活性氧簇)表达的变化。Western Blot结果显示,小鼠分别给予雷公藤各提取部位一周、二周、三周、四周后,各给药组小鼠肾脏中KIM-1的表达和ROS表达和空白组比较增加,并随着给药剂量的增加而上调。其中,给药一周和二周时各给药组KIM-1的升高最显著,给药三周后,KIM-1的升高和空白组比较虽无差异,但有增高趋势,并且高于一周二周。免疫组化发现,给药一周和二周,各组肾脏中Ang-Ⅱ的合成明显降低,和空白组比较差异显著,给药三周后,部分组别出现Ang-Ⅱ合成的增加;雷公藤不同部位给药四周,caspase-3的表达增加,其中乙酸乙酯部位对caspase-3的增加最明显;雷公藤能降低肾组织中GSH的表达,其中正丁醇和乙酸乙酯部位在四周时表达显著性降低;而四周给药对肾脏TLR-4表达的影响不明显。由此得出结论:雷公藤对小鼠肾脏的损伤为急性肾损伤,其损伤作用和增加肾组织中ROS的表达、损伤肾小球影响AngⅡ的合成、促进细胞凋亡和脂质过氧化有关。3.细胞毒性初步探索。取对数期的HK-2细胞,用不同浓度的雷公藤提取部位分别作用12小时、24小时和48小时后,用MTT法观察雷公藤不同提取部位对HK-2细胞活力和增殖的影响,并用Griess试剂比色法测定细胞中NO的释放量。实验结果显示,实验结果显示,不同浓度的雷公藤提取部位作用于HK-2细胞24小时和48小时后,细胞的NO释放量均有显著性增加,并且与空白组相比均有显著性差异,其中,水提物组和其它三个部位相比,NO的释放量相对较少,醇提物部位、正丁醇部位和乙酸乙酯部位这三个部位之间比较,乙酸乙酯部位的NO的释放量略少,醇提物部位和正丁醇部位NO的释放量相当。结果表明,醇提物部位、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水提物部位对HK-2细胞都具有毒性作用,其中醇提物部位和正丁醇部位对HK-2细胞的毒性较大,乙酸乙酯部位的毒性次之,水提物部位的毒性最弱。4.雷公藤长期给药对肾脏的毒性作用研究。用雷公藤醇提提液对大鼠进行灌胃给药,实验动物分四组,分别为高剂量组(11.25g/kg)、中剂量组(5.6g/kg)、低剂量组(2.25g/kg)和空白组,给药组灌胃给予雷公藤提取物,空白组给予等体积的生理盐水,以上各组大鼠分别给药一周、二周、三周、四周、六周、八周,分别于末次给药后收集24h尿液,观察尿液颜色并记录尿量;颈动脉取血,血清用于血液生化检测;取脏器,计算脏器系数,并且进行组织病理学检查。结果显示,雷公藤提取物给药可使大鼠的尿量减少,肾脏系数增大,给药两周后血清中尿素氮(BUN),肌酐(Scr)和K+浓度出现明显的增加,血清白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)浓度明显降低;八周病理组织学检查可见髓质肾小管上皮细胞核固缩,肾乳头部肾小管内可见个别管型以及肾小管的轻微扩张不同程度的肾小管损伤。以上结果说明,雷公藤给药两周大鼠就开始出现明显的肾脏损伤,并随着给药时间的延长和剂量的增加损伤加重。