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骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种以软骨细胞凋亡、软骨基质破坏、软骨下骨骨化、骨赘形成及滑膜炎症反应为特征的综合性慢性疾病,好发于中老年人,给我国的医疗及经济带来巨大负担。骨关节炎的具体发病机制尚未完全阐明,目前认为软骨基质合成和降解的平衡失调,导致软骨基质破坏是关节退化的主要原因。早期的治疗主要包括口服非甾体类消炎药及关节腔注射透明质酸及激素,但这些手段只能缓解疼痛,病情易反复,并容易带来消化系统及心血管系统的副作用。芍药苷(Paeoniflorin,PF)是从中药白芍总苷中提取的单萜类糖苷化合物,来源于芍药科植物芍药根、牡丹根、紫牡丹根。由于其中药单体成分明确,近年来国内外大量学者对其药理药效作用进行了广泛的研究,发现其具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎抗溃疡、抗自由基氧化损伤、解热解痉等作用。在胶原诱导的关节炎模型中,PF能下调炎性因子如白介素1、6、17及肿瘤坏死因子的表达,并上调抗炎因子TGF-β的水平,从而对RA起到治疗作用。在脊柱退变模型的实验中,研究者发现口饲一定剂量的芍药苷能降低大鼠髓核细胞中Bax的含量,同时下调相关凋亡因子的表达,从而抑制髓核细胞的凋亡,对脊柱退行性改变起到保护作用。目前基于芍药苷与软骨细胞的研究探索比较少,我们想通过本研究,明确芍药苷在骨性关节炎病理过程中,是否可以抑制软骨细胞凋亡及软骨基质破坏,从而发挥关节保护作用。本研究主要分三部分:一、首先通过体外培养大鼠软骨细胞,加入不同浓度的PF干预后,用白介素-1β进行刺激,检测软骨细胞中MMPs、TIMP-1基因及蛋白表达的差异,并进一步通过分析检测NF-κB通路的相关蛋白表达水平来明确PF作用机制。我们的研究表明一定浓度的PF能抑制IL-1β介导的MMPs分泌,并上调TIMP-1的表达,从而拮抗IL-1β介导的软骨降解,并且该作用通过部分抑制NF-κB通路得以实现。二、在体外培养的软骨细胞中,观察PF对IL-1β介导的软骨细胞凋亡的影响。通过PF干预后,检测软骨细胞凋亡率、凋亡相关调节基因表达。我们发现PF能上调Bcl-2家族表达并抑制Bax表达,抑制Caspase-3活性,从而拮抗IL-1β介导的软骨细胞凋亡。三、观察在ACLT动物模型中,关节腔注射PF对关节软骨的作用。结果发现一定浓度的PF可减轻关节软骨损伤。我们的研究结果表明,PF很可能通过发挥抗炎及抗凋亡作用从而对关节软骨起到保护作用。第一部分PF对大鼠软骨细胞中MMPs/TIMP-1表达的影响目的:观察PF对IL-1β介导软骨细胞MMPs/TIMP-1表达的影响及其分子机制。方法:取4周龄SD大鼠膝关节软骨组织,用酶消化法行体外培养,传代至3代稳定后,MTT法检测不同浓度PF对软骨细胞活性影响,选取合适浓度范围的PF用于后续实验。加入不同浓度的PF预处理3小时,之后再加入IL-1β 1Ong/ml培养24小时,用实时定量PCR法检测MMP-1,MMP-3,MMP-13及TIMP-1的基因表达,western blot检测MMP-1,MMP-3,MMP-13,TIMP-1、核转录因子p65亚基和转录抑制因子(Inhibitor of nuclear factor kappa B,IκB-α)的蛋白表达。结果:PF能抑制IL-1β介导的MMPs基因及蛋白表达,并上调软骨细胞中的TIMP-1水平。同时PF能抑制IL-1β介导的IκB-α降解和NF-κB磷酸化。结论:PF可通过抑制NF-κB信号通路拮抗IL-1β介导的MMPs基因及蛋白表达,并上调TIMP-1水平。第二部分PF对IL-1β介导的大鼠软骨细胞凋亡的影响目的:观察PF对IL-1β介导的大鼠软骨细胞凋亡的影响及其分子机制探讨。方法:体外培养SD大鼠软骨细胞,待细胞活性稳定后,用不同浓度PF预处理3小时,之后加入IL-1β1Ong/ml培养24小时,通过乳酸脱氢酶活性检测及流式细胞检测明确PF对软骨细胞凋亡的作用,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性,实时定量PCR法检测Bcl-2及Bax基因表达,Western blot检测Bcl-2,Bax,总Akt和磷酸化Akt的蛋白表达。结果:PF能通过上调Akt磷酸化,拮抗IL-1β介导的LDH释放及抑制软骨细胞的凋亡,并上调Bcl-2表达,抑制Bax表达及Caspase-3活性。结论:PF能抑制IL-1β介导的LDH释放,透过流式细胞技术PF能拮抗IL-1β介导的软骨细胞凋亡。进一步的分析表明PF能通过上调Bcl-2基因及蛋白表达,并下调Bax水平,同时降低Caspase-3的活性来发挥凋亡作用。该作用与Akt通路密切相关。第三部分PF对兔OA模型的保护作用目的:通过建立动物模型进一步观察验证PF对骨关节炎的保护作用。方法:32只新西兰兔均分为正常组、空白组、低剂量PF组及高剂量PF组。后三组共24只行单侧前交叉韧带离断法制作OA模型。建模4周后,分别予0.3mlDMSO、0.3ml低剂量PF(25μM 及0.3ml高剂量PF(50μM)注射,每周一次,持续5周。末次注射后1周取膝关节组织,进行实时定量PCR及组织学制片。结果:PF显著抑制关节软骨退变时MMP-1,MMP-3和MMP-13的基因表达,并上调软骨细胞中的TIMP-1水平。组织学评分及番红染色提示PF能够抑制关节软骨中蛋白聚糖丢失。结论:动物模型实验中PF能下调降解因子的表达,对关节软骨起保护作用。