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昆虫抗菌肽(Antibacterial peptide)是昆虫遭受外界异物的刺激或病原微生物的感染而快速产生的一类具有生物活性的短链多肽。具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及无免疫原性等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望发展成为新一代肽类抗生素。
死亡素(thanatin)来自昆虫斑腹刺益蝽(Podzsus maculiventris),是近来发现抗菌谱最广的抗菌蛋白,它不仅对革兰氏阳性、革兰氏阴性菌有抗性,而且对真菌也有杀灭活性,其作用方式可能是阻断细胞膜上的呼吸链,其广谱的杀菌活性,独特的杀菌机制预示其有广阔的应用前景。
为了高效表达可溶性的抗菌肽thanatin,并为廉价的生产抗菌肽提供分子平台。本研究利用RT-PCR扩增了家蝇泛素基因ubiqutin,并和死亡素基因thanatin构成嵌合基因,克隆到表达载体pET-32a,构建表达载体pET-UBI-THA。将酶切和PCR鉴定正确的质粒转化表达宿主菌BL21.(DE3),经IPTG诱导,ubiqutin-thanatin得到了高效可溶性表达。SDS-PAGE检测表明thanatin的表达量占菌体总蛋白的36%。Western blot分析表明ubiqutin-thanatin能与Ni-NTA鏊合物特异性的结合,表明在 ubiqutin-thanatin的N端带有6His标签。利用Ni-NTA亲和柱一步纯化了融合蛋白,纯化率为90%。
为了从融合蛋白中释放出具有杀菌活性的抗菌肽thanatin,本研究利用6His-tag的特点,构建了N-末端带有6xHis纯化标签的酿酒酵母泛素水解酶基因(yeast ubiqutinhydrolase,YUH)原核表达载体pET-YUH,并实现了在宿主菌DE3高效表达,采用镍金属螯合层析一步纯化目的蛋白YUH。
利用纯化的YUH对融合蛋白6His-ubiquitin-thanatin进行切割,切割产物经Ni-NTA亲和柱和HPLC纯化后,Tricince-SDS-PAGE电泳检测表明,纯化的thanatin为单一的蛋白条带,得到较纯净的thanatin,电喷雾质谱(ESI-MS)分析表明,纯化的thanatin分子量为2.56kDa,与通过氨基酸预测的分子量完全一致。利用琼脂孔穴扩散法和液相法对thanatin活性检测表明,纯化的thanatin不仅对大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较强的抑制活性。
以上结果表明,分子伴侣泛素不仅可以提高外源蛋白地表达量,而且增加外源蛋白的可溶性,融合蛋白可以特异性的被YUH识别并切下泛素C末端的融合蛋白,得到具有天然活性地抗菌肽。