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背景肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一。随着血清甲胎蛋白(AFP)检测的普及,影像学检查技术的进步以及人们健康意识的提高,近年来对于早期肝癌的诊出率较以前有了明显的提高,虽然外科手术技术以及微创治疗技术的日渐成熟和大范围推广,但肝癌的总体预后仍不理想,这与肝癌侵袭性和转移能力强密不可分。MicroRNA(miRNA)是长约20～25个核苷酸,具有调控功能的内源性非编码RNA。越来越多的研究表明miRNAs与肝癌的发生、转移、侵袭及预后密切相关。miR-346在多种肿瘤中发挥癌基因的功能,但miR-346在肝癌发生发展中的报道还很少见。我们首先检测了 miR-346在肝癌组织和肝癌细胞中的表达水平,并分析与肝癌患者临床病理特征和预后的关系,以及对肝癌细胞生物学行为的影响。然后通过生物信息学软件预测并在体内外实验中证实miR-346通过抑制BRMS1的表达促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,并减少肝癌细胞凋亡,为肝细胞肝癌的治疗提供了新的靶点。第一部分miR-346在肝癌中的表达及生物学功能研究目的研究miR-346在肝癌组织中的表达情况及其与临床病理特征和预后之间的关系;分析miR-346对肝癌细胞系生物学行为的影响及其机制。方法1、收集标本,应用Real-time PCR技术检测肝癌组织及配对癌旁组织中miR-346的表达水平,并分析其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。2、Real-time PCR技术检测5种肝癌细胞系和人正常肝上皮细胞中miR-346的表达水平。3、上调或下调miR-346的表达水平,分析miR-346对肝癌细胞系生物学行为的影响。结果1、miR-346在肝癌组织中的表达水平高于配对的癌旁组织,且与TNM分期(P=0.038)、肿瘤大小(P=0.028)以及转移(P=0.037)有关,而与年龄、性别以及甲胎蛋白并无明显相关性(P>0.05)。2、miR-346在TNM Ⅲ和Ⅳ期的肝癌患者中的表达水平高于Ⅰ和Ⅱ期的肝癌患者;在大于5cm的肝癌患者中的表达水平高于不大于5cm的肝癌患者;在发生转移的肝癌患者中高于未发生转移的肝癌患者,且miR-346高表达的肝癌患者总生存期更短。3、在肝癌细胞中过表达miR-346促进肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,减少细胞凋亡。4、在肝癌细胞中低表达miR-346抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进细胞凋亡。5、miR-346不影响肝癌细胞的细胞周期。第二部分 miR-346与BRMS1的靶向关系研究目的生物信息学软件预测miR-346的靶基因并对其进行验证;分析靶基因与肝癌患者临床病理特征和预后的关系;细胞学实验分析靶基因对肝癌细胞系生物学行为的影响。方法1、通过生物信息学软件Targetscan和Pictar在线预测miR-346的靶基因。2、在上调或下调miR-346表达的肝癌细胞系中,检测BRMS1在mRNA和蛋白水平表达的变化。3、双荧光素酶报告基因实验验证miR-346能够负调控BRMS1的表达。4、应用Real-time PCR技术检测肝癌组织及配对癌旁组织中BRMS1 mRNA的表达水平。5、通过组织芯片免疫组织化学染色分析肝癌组织及癌旁组织中BRMS1蛋白的表达水平,并分析BRMS1的表达水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。6、在肝癌细胞中利用表达载体pcDNA3.1-BRMS1上调BRMS1的表达,并分析BRMS1过表达对肝癌细胞生物学行为的影响。7、共转染miR-346 inhibitors和siBRMS1,分析干扰BRMS1的表达是否能够逆转miR-346 inhibitors对肝癌细胞生物学行为的抑制作用。结果1、肝癌细胞系中,miR-346能够靶向抑制BRMS1的表达。2、Real-time PCR检测40对肝癌组织及配对癌旁组织中BRMS1 mRNA的表达水平,发现BRMS1的表达水平在肝癌组织显著低于癌旁组织(P<0.05)。3、组织芯片免疫组织化学染色在蛋白水平进一步验证了 PCR的结果。按免疫组化评分,将肝癌患者分为BRMS1低表达组和高表达组,并分析其与临床病理特征及预后的关系,从统计分析中我们发现,BRMS1的表达水平与TNM分期(P=0.009)、是否转移(P=0.005)有关,而与年龄(P=0.875)、性别(P=0.628)、AFP(P=0.369)和肿瘤大小(P=0.093)之间的差异无统计学意义。此外,BRMS1低表达组的肝癌患者总生存期更短。4、过表达BRMS1抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,促进肝癌细胞凋亡。与 miR-346 inhibitors 的结果一致。5、干扰BRMS1的表达可以逆转miR-346 inhibitors对肝癌细胞生物学行为的抑制作用。第三部分miR-346在裸鼠成瘤中作用机制的研究目的通过裸鼠成瘤实验,在体内进一步验证miR-346通过调控BRMS1的表达,促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞凋亡。方法1、将过表达miR-346的SMMC-7721细胞以及阴性对照SMMC-7721细胞分别注入裸鼠皮下,观察裸鼠成瘤情况。2、小动物活体成像系统动态观察瘤体的大小变化。3、游标卡尺测量瘤体大小,绘制瘤体体积的折线图。4、免疫组化技术检测瘤体内BRMS1和caspase-3的表达水平。Westernblot检测瘤体内BRMS1、PCNA、Bcl-xL和caspase-3蛋白的表达水平。5、RT-PCR技术检测瘤体内miR-346的表达水平和BRMS1 mRNA的表达水平,并作相关性分析。结果1、过表达miR-346能够促进裸鼠移植瘤的增殖速度。2、瘤体的免疫组化:miR-346过表达组BRMS1和caspase-3表达水平降低。Westernblot:miR-346过表达组中,BRMS1蛋白表达水平降低,PCNA蛋白表达水平升高,凋亡抑制蛋白Bcl-xL蛋白表达水平升高,促凋亡蛋白caspase-3蛋白表达水平降低。3、瘤体内miR-346的表达水平与BRMS1 mRNA的表达水平负相关。4、BRMS1是miR-346的下游靶基因,miR-346通过靶向调控BRMS1的表达进而促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞凋亡。全文结论1、肝癌组织中miR-346的表达水平明显升高,且与肝癌患者的TNM分期、肿瘤大小以及转移有关,而且miR-346高表达的肝癌患者总生存期短。可见miR-346在肝癌的发生发展过程中起到癌基因的作用。2、BRMS1在肝癌组织中低表达,其低表达与肝癌患者预后差相关。提示在肝癌的发生发展过程中BRMS1起到抑癌基因的作用。3、体内外实验证实BRMS1是miR-346的直接靶基因。miR-346通过对BRMS1的负调控,参与肝癌疾病的进展。4、miR-346/BRMS1调节轴在肝癌的发生发展中发挥了重要的作用,有望成为肝癌治疗的新靶点。