CRISPR/Cas是一种新型的基因编辑技术,这种技术吸引了很多科学家对这项技术进行一系列研究。CRISPR/Cas是细菌及古细菌为抵御外来基因进化出来的获得性免疫防御机制,相比于前几代碱基编辑技术,CRISPR/Cas9的成本低、操作简便、效率高,成为了科研人员进行碱基编辑的有力帮手。Cas9的突变体nCas9与脱氨酶ec Tard A相结合构建的nCas9-ABE编辑器,可以在不切断DNA,不提供修复模板的情况下实现DNA的定位碱基突变。但是现有的碱基编辑器编辑效率不高,编辑窗口不理想。另外,由于nCas9-ABE融合基因的分子量较大,从而制约着DNA通过慢病毒递送到哺乳动物胞内的效率。为了应对上述问题,本研究开展了一系列研究,并取得了如下成果:第一,构建了一种基于蛋白质内含子（Intein）的nCas9-ABE碱基编辑器。改进碱基编辑器ABE,本研究将nCas9-ABE碱基编辑系统与蛋白质剪接机制相结合,构建了基于蛋白质内含子（Intein）的nCas9-ABE碱基编辑器,使得nCas9和脱氨酶ecTard A可以分别表达,并在胞内通过Intein作用构建成融合蛋白。第二,建立了基于Rparr的碱基编辑效率检测体系。为了探究该碱基编辑器的编辑效率和编辑窗口,本研究首先建立了基于Rparr的编辑效率检测体系。结果表明,基于Intein的nCas9-ABE碱基编辑器可以成功的将Rparr基因内终止密码子TAG恢复突变为非终止密码子CAG,从而恢复Rparr的利福平降解功能,并使编辑后的大肠杆菌可以在含有利福平的培养基上生长。另外,测序结果表明,目标编辑位点周围未发现其它突变,表明该编辑系统具有较高的保真性和理想的编辑窗口。第三,建立了基于SacB的碱基编辑效率检测体系。为进一步验证该系统的编辑效果,本研究还构建了基于Sac B的活性检测系统,旨在通过对该基因互补链的编辑,使不含信号肽的Sac B基因内的终止密码子TAA恢复为非终止密码子CAA,从而使得表达该基因的大肠杆菌在含有蔗糖的培养基中呈现半透明液泡状菌落。结果表明,编辑后的菌株未形成特殊形态的菌落,说明该编辑器对不同基因的识别方面可能存在一定的特异性。第四,构建了一种基于PB1-PB2相互作用的大肠杆菌ABE碱基编辑器。本研究还尝试利用人类流感病毒蛋白PB1的C末端（PB1-Cter）和PB2的N末端（PB2-Nter）之间可形成特异性相互作用的原理,将PB1-Cter和ec Tard A融合,并将PB2-Nter于nCas9融合,使其分别表达后,在胞内形成复合物,而从降低融合基因的大小,并改变胞内复合物中nCas9和ec Tard A之间“linker”的长度。结果表明,通过Rparr的活性检测,发现编辑后菌落数目比对照增加了40-256%,显示出更高的编辑效率。另外,研究还发现添加IPTG的量可以通过重组蛋白表达量的变化而影响到编辑效率。综上所述,本项目分别建立了基于Intein和PB1-PB2的两种改进的大肠杆菌nCas9-ABE碱基编辑系统,并且通过基于Rparr的活性检测体系证明这两种碱基编辑器都具有较高的编辑活性和较窄的编辑窗口,为后续的进一步功能验证和改造奠定基础。