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目的据世界卫生组织(WHO)的统计数据表示,2018年肿瘤新发病例为1800多万例,因肿瘤死亡的人数高达955万,而宫颈癌在不分性别、所有年龄段的新发肿瘤中排名第八。在肿瘤的治疗上,常用的有五大治疗方法:手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗和肿瘤热疗。但由于毒性大、费用高、周期长、复发率高和安全性等原因,肿瘤患者的生存率仍达不到理想水平;而宫颈癌疫苗对于非HPV感染以及处于发展阶段的宫颈癌患者效果不大。本文旨在探索功效较多的小分子化合物二甲双胍与HIV抑制剂奈非那韦联合作用于宫颈癌的潜在作用机制。自噬是癌症治疗的一个重要方向,而且活性氧的产生与癌症的发生息息相关。本文将进一步揭示二甲双胍与奈非那韦联合作用于宫颈癌的作用机制及两药的作用效果与自噬的关系,探索二者联合是否通过线粒体相关的SITR3/mROS途径增强宫颈癌细胞的自噬作用,从而达到抗宫颈癌的效果。方法1.采用透射电镜检测无处理、二甲双胍(10mmol/L)、奈非那韦(4μmol/L)以及联合用药(二甲双胍10mmol/L+奈非那韦4μmol/L)处理的HeLa和SiHa细胞,通过形态学方法观察自噬体的累积情况。2.采用蛋白免疫印迹方法(Western Blot)检测二甲双胍或/和奈非那韦处理后自噬相关蛋白:LC3II/I、Beclin-1、Atg7、Atg3、与线粒体活性氧(mROS)产生的相关蛋白SIRT3的表达情况。3.采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验评估二甲双胍或(和)奈非那韦处理后对自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性;采用蛋白免疫印迹法检测与NK细胞毒性相关蛋白MICA的表达。4.采用裸鼠宫颈癌异种移植模型,评估二甲双胍和奈非那韦联用的抗肿瘤效果:构建裸鼠异种皮下移植瘤模型,给药后每三天测量一次裸鼠瘤体大小,观察药物单用(联用)对移植瘤裸鼠生长情况及移植瘤大小的影响。取肿瘤组织,采用蛋白免疫印迹法验证自噬相关蛋白以及与mROS产生、NK细胞毒性相关的系列蛋白的表达变化。结果1.透射电镜结果显示,与单用二甲双胍或奈非那韦组相比,二甲双胍联合奈非那韦处理后,HeLa和SiHa细胞系中出现明显的自噬体累积现象,推测联合用药抑制宫颈癌可能与自噬有关。2.蛋白免疫印迹(体内外样本)实验结果显示,相对于单用二甲双胍或奈非那韦,二甲双胍联合奈非那韦处理HeLa、SiHa后,自噬标志蛋白LC3II/I表达上升,Beclin-1、Atg3、Atg7表达下降;与mROS产生相关的SIRT3表达上升,提示联合用药产生的自噬可能与SIRT3/mROS有关。3.LDH细胞毒性实验显示,二甲双胍联合奈非那韦可以增强NK细胞介导的毒性作用;蛋白免疫印迹实验显示,与增强NK细胞毒性的相关蛋白MICA表达上升,提示两药联用后可以增强NK细胞对宫颈癌细胞HeLa和SiHa的杀伤作用。4.裸鼠宫颈癌异种移植结果显示,二甲双胍联合奈非那韦抑制肿瘤生长效果比单用二甲双胍或奈非那韦效果好,而且自噬相关蛋白LC3II/I、Beclin-1以及与mROS产生相关的SIRT3蛋白、增强NK细胞毒性相关的MICA蛋白表达也有不同程度的变化。结论二甲双胍和奈非那韦联合作用于宫颈癌起协同作用,引起自噬相关蛋白发生变化:LC3II/I表达上调,Beclin-1、Atg3、Atg7表达下调。同时,上调线粒体SIRT3,引起mROS的增加,诱导宫颈癌发生自噬。此外,还可以上调肿瘤细胞表面MICA,增强NK细胞的裂解作用,从而促进宫颈癌细胞凋亡,抑制宫颈癌生长。