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心脏的发育是一个极其复杂的过程,斑马鱼模型是研究心脏发育的分子机制的理想模型之一。Myh6是心脏发育的标志基因,促进心室心肌细胞扩张；Nodal是调节心脏左右不对称发育的关键基因。目前在斑马鱼模型中很少有利用抗体在蛋白水平进行基因功能研究的报道。果蝇CG3295基因(脊椎动物同源基因是RMND5A/B)是我室发现的心脏发育候选新基因,其功能目前尚未有报道。本文进行了这3个基因的抗体制备及蛋白表达研究。为了获得斑马鱼Myh6和Nodal的表达质粒,用斑马鱼组织提取RNA,通过反转录得到cDNA模板。通过PCR扩增得到440bp的Myh6亲水性片段,将其连接到pGEX-4T载体上获得原核表达质粒。经酶切及测序鉴定后,转化BL21细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western Blotting检测分析表明,抗体效价为1：1000。进一步用Myh6多克隆抗体进行斑马鱼组织的蛋白表达检测,证明Myh6蛋白在心脏和肌肉中表达。斑马鱼胚胎免疫组化分析表明,可在心脏组织中检测到Myh6蛋白表达信号。用斑马鱼cDNA为模板通过PCR扩增得到309bp的Nodal的亲水性片段,连接到pET-28a载体上获得原核表达质粒,转化Rosseta细菌,用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western Blotting检测分析表明,抗体效价为1：1000。进一步用斑马鱼组织蛋白和胚胎蛋白表达检测,表明Nodal蛋白在斑马鱼包括心脏的多个组织表达,并且在斑马鱼多细胞期胚胎就开始有所表达。为了获得果蝇CG3295的表达质粒,用果蝇组织提取RNA,通过反转录得到cDNA模板。利用PCR扩增得到540bp的CG3295亲水性片段,连接到pET-28a载体上获得原核表达质粒,转化Rosseta细菌,经IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western Blotting检测分析表明,抗体效价为1：1000。进一步用果蝇胚胎蛋白检测CG3295蛋白表达,实验结果表明,在果蝇不同的胚胎期,CG3295的表达量变化很大,但在果蝇胚胎心脏前体细胞形成到心脏细胞分化阶段表达量稳定。果蝇胚胎免疫组化分析表明,CG3295蛋白在心脏等多种组织表达。上述结果表明,制备的Myh6、Nodal和CG3295多克隆抗体效价高,能分别通过胚胎组织的免疫组化技术研究这些基因在斑马鱼和果蝇体内的蛋白表达,为进一步研究基因在生物体内的功能奠定了基础。