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随着大气层臭氧的减少,地面植物受到的UV-B辐射逐渐增强。低剂量的UV-B辐射(<8KJ·m–2·d–1)会让植物通过自身形态建成的变化来避免植物受到更多损害,而高剂量的UV-B辐射(>8KJ·m–2·d–1)下,植物会产生DNA损伤,细胞膜变化和蛋白降解,从而影响植物生理代谢过程,对经济作物的产量产生很大影响。所以我们通过研究增强UV-B辐射在分子水平上对植物本身产生的影响,为优良品质作物育种提供理论依据。
本研究采用翼麦325为研究材料,利用病毒诱导基因沉默的方法,构建小麦TaPCNABSMVVIGS载体,通过烟草做中间介质,将携带TaPCNA的病毒,接种到小麦中诱导小麦TaPCNA沉默,并通过增强UV-B辐射处理共同探究PCNA(增殖细胞核抗原,ProliferatingCellNuclearAntigen)在小麦中的功能。本研究采用VIGS技术下调小麦TaPCNA的表达量,探究PCNA在小麦中的功能,主要的研究结果如下:
1.成功构建pCaBs-γ:Tapcna-1和pCaBs-γ:Tapcna-2病毒载体;
2.观察接种病毒后烟草的表型,发现接种7天之后叶子就会出现病毒感染的斑点症状,并且在感染后期还发现叶子出现明显卷缩,植株矮小。将出现病毒感染现象的烟草叶用来接种小麦,接种后发现小麦植株叶片有病毒感染现象,并且在病毒感染期发现沉默基因的处理组株高要矮于WT和BSMV:00。
3.生长率的统计结果显示,TaPCNA沉默以后小麦生长明显受阻,并且在增加UV-B辐射以后,BSMV:Tapcna-1+B、BSMV:Tapcna-2+B处理组生长几乎停滞,未接种病毒的WT+B生长也受到影响。进一步对WT、BSMV:00、BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2的叶肉细胞长度进行统计,发现沉默组细胞长度要小于WT和BSMV:00。
4.生理生化指标的测定显示,BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2处理组可溶性糖和可溶性蛋白含量降低,说明沉默后植株生长受到影响,代谢变慢。POD和CAT、SOD活性降低,和MDA含量升高,说明沉默以后可能影响到了小麦的抗氧化系统。在增加UV-B辐射以后,损伤加剧,说明由于沉默TaPCNA后,使得小麦生长受损,而增加UV-B以后,让受损加剧,而且发现BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2和WT+B、BSMV:00+B表现出类似现象。
5.通过DNAladdering现象,和PI染色实验,发现沉默组,以及加入UV-B辐射的处理组都会出现不同程度的DNA条带弥散以及小分子量DNA片段的积累。
综上,本研究首次从小麦表型、生理生化水平,以及细胞水平方面探讨了小麦中PCNA在细胞凋亡中可能行使的功能,也为探究增强UV-B辐射诱导小麦产生DNA损伤的信号通路提供了一个新的角度,进而为发现PCNA在小麦中的更多功能提供基础,也为发现增强UV-B辐射对小麦损伤的分子生物学机制提供一定的依据。
本研究采用翼麦325为研究材料,利用病毒诱导基因沉默的方法,构建小麦TaPCNABSMVVIGS载体,通过烟草做中间介质,将携带TaPCNA的病毒,接种到小麦中诱导小麦TaPCNA沉默,并通过增强UV-B辐射处理共同探究PCNA(增殖细胞核抗原,ProliferatingCellNuclearAntigen)在小麦中的功能。本研究采用VIGS技术下调小麦TaPCNA的表达量,探究PCNA在小麦中的功能,主要的研究结果如下:
1.成功构建pCaBs-γ:Tapcna-1和pCaBs-γ:Tapcna-2病毒载体;
2.观察接种病毒后烟草的表型,发现接种7天之后叶子就会出现病毒感染的斑点症状,并且在感染后期还发现叶子出现明显卷缩,植株矮小。将出现病毒感染现象的烟草叶用来接种小麦,接种后发现小麦植株叶片有病毒感染现象,并且在病毒感染期发现沉默基因的处理组株高要矮于WT和BSMV:00。
3.生长率的统计结果显示,TaPCNA沉默以后小麦生长明显受阻,并且在增加UV-B辐射以后,BSMV:Tapcna-1+B、BSMV:Tapcna-2+B处理组生长几乎停滞,未接种病毒的WT+B生长也受到影响。进一步对WT、BSMV:00、BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2的叶肉细胞长度进行统计,发现沉默组细胞长度要小于WT和BSMV:00。
4.生理生化指标的测定显示,BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2处理组可溶性糖和可溶性蛋白含量降低,说明沉默后植株生长受到影响,代谢变慢。POD和CAT、SOD活性降低,和MDA含量升高,说明沉默以后可能影响到了小麦的抗氧化系统。在增加UV-B辐射以后,损伤加剧,说明由于沉默TaPCNA后,使得小麦生长受损,而增加UV-B以后,让受损加剧,而且发现BSMV:Tapcna-1、BSMV:Tapcna-2和WT+B、BSMV:00+B表现出类似现象。
5.通过DNAladdering现象,和PI染色实验,发现沉默组,以及加入UV-B辐射的处理组都会出现不同程度的DNA条带弥散以及小分子量DNA片段的积累。
综上,本研究首次从小麦表型、生理生化水平,以及细胞水平方面探讨了小麦中PCNA在细胞凋亡中可能行使的功能,也为探究增强UV-B辐射诱导小麦产生DNA损伤的信号通路提供了一个新的角度,进而为发现PCNA在小麦中的更多功能提供基础,也为发现增强UV-B辐射对小麦损伤的分子生物学机制提供一定的依据。