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脆性X综合征(Fragile X syndrome，FXS)是常见的遗传性智力低下疾病之一。临床表现多样，主要表现为中到重度的智力低下，常伴有巨睾、特殊面容、多动症、癫痫发作，大量患者脑电图存在特征性弥漫性瞬间慢波发放等临床病理表现。超过99％的FXS是由位于Xq27.3的脆性X智力低下基因1(fragile X mental retardation 1，FMR1)5’端非编码区(CGG)_n三核苷酸重复序列的异常扩增及CpG岛的异常甲基化引起FMR1编码产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)的表达下降或缺失所导致。分别定位于3q28及17p13.1的脆性X相关基因1／2(fragile X related gene 1／2，FXR1／2)被发现与FMR1具有高度的序列及结构相似性，且可两两以同源或异源二聚体形式存在，三者统称为脆性X基因家族。FXR1／2类似于FMR1也具有与蛋白质结合的功能及与mRNA结合的功能，而且本身也可以与FMR1 mRNA、FMRP相互作用，可能与FXS的发病密切相关。目前的研究提示，脆性X综合征的发病与FMR1、FXR1／2三个基因相关，且三者存在相互作用，故本论文围绕FMR1、FXR1这两个基因(FXR2目前仅构建了基因载体)分四个部分开展了FXS发病分子机制的研究。首先，对于FMR1基因，主要应用酵母三杂交技术从表达调控的角度在蛋白质表达文库中筛选FMR1 mRNA 3’-非翻译区的调控蛋白，并且通过建立高效快速的诊断方法，研究不同种族此基因结构的差异；对于FXR1基因，则通过应用酵母双杂交系统筛选并经免疫共沉淀验证FXR1P的相互作用蛋白；最后应用酵母三杂交系统在RNA表达文库中筛选能与FXR1P相互作用的mRNA，以期能找到一些从基因表达异常到临床发病的相关环节或网络关系，初步构建蛋白质-蛋白质、蛋白质-mRNA相互作用网络调控图谱，为揭示FXR1P的功能及其与脆性X综合征的发病机制的关系提供新的线索。四部分研究内容、意义及结果如下：FMR1基因5’-非翻译区(CGG)_n重复数目是临床上诊断FXS的重要标准，建立一种(CGG)_n重复数目的确定方法对FXS的高效快速筛查和产前诊断具有重要意义，研究中国不同种族(CGG)_n重复序列的多态性可助进一步阐明FMR1基因的遗传特征，针对FMR1的5’端GC碱基高度富集，DNA双链较难解链，本研究采用了耐高温酶及碱基替代法、PCR增效剂的添加及提高退火温度，改善扩增条件，对FMR1基因中GC含量较高的重复序列进行扩增，分别对汉族与壮族人群FXS遗传性标记序列的多态性进行研究，建立了一种稳定快速、适合大规模正常人群检测(CGG)_n重复数及研究其多态性的方法。发现汉族人群和壮族人群X染色体(CGG)_n重复数最大值分别为28及29。FMR1基因在翻译水平上的表达调控异常可能导致FXS患者FMR1的表达水平下降，因此筛选FMR1基因的mRNA 3’UTR相互结合蛋白的工作对于阐明FXS发病机理也具有探索性的意义。本研究构建了酵母三杂交系统pRH3／FMR1 mRNA 3’UTR的Bait质粒，转染酵母菌株L40-ura3／pHybLex／Zeo-MS2，共转化法从人脑海马回pYESTrp3-cDNA文库中筛选了FMR1 mRNA 3’UTR的作用蛋白，将获得的阳性质粒与诱饵质粒重新转入酵母菌内，对RNA-蛋白质作用进行一对一验证，对验证后的阳性克隆的外源性片断进行测序及同源性分析，发现了两种可能与FMR1 mRNA 3’UTR具有相互作用的蛋白：K-Alpha-1及Homo sapiens hypothetical protein，我们推测这两种蛋白可能通过与FMR1 mRNA 3’UTR相互结合而在翻译水平上对FMR1进行表达调控。FXR1基因编码蛋白的系列相互作用蛋白的筛选以及验证将有助于FXR1基因功能的阐明。本实验构建了酵母双杂交系统诱饵质粒pGBKT7-FXR1，并将其转化酵母菌AH109，与转化了Matchmaker人胎脑pGADT7-cDNA文库质粒的酵母菌Y187进行配合(Mating)，通过一系列报告基因的表达检测筛选阳性克隆，将经酶切鉴定后阳性克隆质粒AD／Library转化Y187再与诱饵质粒pGBKT7-FXR1酵母菌进行一对一小交配验证蛋白质的相互作用，真阳性克隆的AD／Library质粒测序及生物信息学分析，一共得到了七种可能与FXR1P相互作用的蛋白：Btf，SAFB，CMAS，FTH1，GOLGA4，HSD17B1，CSH1；随后进行的免疫共沉淀验证实验，构建了4个真核表达载体pCMV-FXR1-Myc，pCMV-Flag-FXR1，pCMV-Btf-Myc，pCMV-SAFB-Myc，对FXR1P与Btf、SAFB的相互作用进行了哺乳动物细胞内的免疫共沉淀验证，发现FXR1P与SAFB不能在细胞内发生相互作用，而能够与Btf相互作用。据此，可以认为Btf是FXR1P蛋白调控网络的新成员，在神经、肌肉等组织生长发育过程中发挥一定的作用。FXR1基因编码蛋白的系列相互作用靶mRNA的筛选有助于FXR1P的表达调控功能与FXS发病机制的探讨。本研究应用酵母三杂交技术以构建好的诱饵质粒pYESTrp3／FXR1从人脑海马回pRH3’-cDNA文库(RNA表达文库)中对FXR1P的相互作用mRNA进行了筛选，得到56个His~+和LacZ~+阳性克隆，将初步获得的阳性质粒与诱饵质粒一对一重新转入酵母体内，对RNA-蛋白质相互作用进行回转验证，共获得9个阳性克隆。最后对阳性克隆测序并进行同源性分析，获得3个插入方向正确的候选基因(LENG4、IQCE、DPP7)的mRNA，FXR1P可能通过结合LENG4、IQCE、DPP7的mRNA对这三种基因进行表达调控。