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番茄(LycopersiconesclulantumMill)是重要的蔬菜和经济作物,在世界范围内广泛栽培。番茄病毒病使番茄的产量下降和品质降低,造成严重的经济损失。番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)是两种侵染我国番茄的主要病毒,在全国各地均有发生。本研究的主要目的是建立以植物组织内的18SrRNA为内参照的多重RT-PCR体系同时检测这两种病毒,通过特异性引物的设计区分侵染番茄的ToMV和烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV),区分CMV亚组Ⅰ和亚组Ⅱ,以及检测CMV携带的卫星RNA(satRNA),为番茄流行病毒病的调查和检验检疫部门等提供技术支持。
为了建立多重RT-PCR体系,本研究利用待检目的片断的cDNA克隆为模板,首先建立多重PCR体系,利用多重PCR体系评价引物的特异性和获得多重RT-PCR体系的基本反应条件。以混合的各感病番茄叶片为材料提取总RNA,进行逆转录(reversetranscription,RT)反应,以RT产物为模板进行多重RT-PCR体系的优化条件试验,建立多重RT-PCR体系。实验结果表明,以cDNA克隆为模板的多重PCR体系的反应条件适合于以RT产物为模板的多重RT-PCR体系。与常规的多重RT-PCR体系的建立过程相比,本方法可以对模板浓度加以调节和控制,从而快速的建立多重RT-PCR体系。经过优化的多重RT-PCR体系的反应条件为:10μL逆转录反应体系中各组份的含量为0.4μLCMVⅡR,0.1μLCMVⅠR,0.6μLTMV(ToMV)R,0.1μLsatRNAR,2μL(4~5μg)总RNA,0.25μLRNaseInhibitor(40U/μL),2μLdNTP(2.5mM),2μL5×AMVbuffer,0.25μLAMVReverseTranscriptase(5U/μl);25μL的多重PCR体系中各组份的含量为2.5μL10XPCRbuffer(Mg2+),2μLdNTP(2.5mMeach),0.5μLMg2+(25mM),0.4μLTaq聚合酶(5U/μL),1μLRT产物,0.75pLCMVⅡF/R,0.125μL,CMVⅠF/R,0.5μLTMVF/R,0.125μLsatRNAF/R,0.125μL18SrRNAF/R。
本研究利用建立的多重RT-PCR体系对田间的番茄样品进行检测,对30个样品进行了单一RT-PCR检测。结果表明,在检测ToMV和CMV时,多重RT-PCR体系和单一RT-PCR有一致的检测结果,而在检测satRNA时,多重RT-PCR体系的检测结果常有不明显的非特异性扩增条带,可靠性较低。在54份样品中,检测到CMV的有38个,ToMV的有12个,其中包括CMVS-Ⅰ和CMVS-Ⅱ复合侵染的2个样品,CMVS-Ⅱ和ToMV复合侵染的3个样品及CMVS-Ⅰ和ToMV复合侵染的4个样品。
本研究还以CMV-Fny,CMV-CB7和CMV-LS作为参照按照Chen建立的方法对检测到的CMV基因组进行酶切分析。结果表明,对于检测到的CMV,其三条基因组最常见的酶切图谱分别与CMV-FnyR1,CMV-FnyR2和CMV-CB7R3的酶切图谱相似。这与报道的图谱类型有明显差异,要确定其是否为一种新的图谱类型或者是CMV亚组Ⅰ内的假重组体,还需要进一步的研究。