硼(B)是植物必需的微量营养元素,缺硼导致作物减产品质下降。油菜是我国重要的油料作物,其中80%的油菜种植品种为甘蓝型油菜,而我国种植甘蓝型油菜的区域普遍缺硼,研究油菜抗缺硼的分子机制对油菜硼营养性状遗传改良和硼肥施用有重要的理论实践意义。甘蓝型油菜品种的硼吸收、转运、利用和分配硼的效率受基因型影响,实验室前期研究发现硼转运子基因与油菜硼高效机制有关。本文研究了甘蓝型油菜硼转运子Bna C4.BOR1;1c的功能,探讨了它在甘蓝型油菜成熟期花序发育和生殖中的作用以及不同品种间Bna C4.BOR1;1c启动子差异对硼效率的影响。取得了以下主要研究结果:1.通过油菜基因组数据库,在全基因组水平上鉴定了BOR家族的20个成员,通过生物信息学分析对BOR家族进行了理化性质、系统发生树、基因结构、染色体定位和蛋白结构的分析;发现油菜BOR家族基因与拟南芥BOR家族基因有高度的同源性,与拟南芥At BOR的7个成员相比对,可以将油菜BOR家族分为六组,但是都具有保守的结构域,说明其可能与拟南芥At BOR1具有类似的硼转运的功能。通过不同硼条件下对其家族成员的表达模式进行分析,发现各成员间表达模式截然不同,例如Bn BOR4C02只在根中表达;其丰富的表达模式也预示着它们功能的多样性。2.通过甘蓝型油菜硼转运子Bna C4.BOR1;1c基因的启动子连接GUS报告基因及其c DNA连接GFP绿色荧光蛋白基因转化拟南芥,分析了Bna C4.BOR1;1c的组织和细胞定位。GUS染色结果发现Bna C4.BOR1;1c基因在拟南芥苗期根中柱维管组织、莲座叶基部和花蕾期地上部节点、幼嫩花蕾中显著强的表达,而且随着花蕾的发育,GUS的活性都集中在花蕾的节点处。亚细胞定位结果显示Bna C4.BOR1;1c定位在细胞质膜上,并且整个根中都有表达,包括分生、过渡和成熟区,特别是在维管组织周围有强烈的表达。结果说明油菜Bna C4.BOR1;1c与拟南芥BOR1基因有相同的表达模式,在油菜中有其特异的表达组织器官。3.在拟南芥生态型Col-0及突变体bor1-1和nip5;1-1中过量表达Bna C4.BOR1;1c,发现不论正常硼(30μM B)还是缺硼(0.3μM B)条件下,Bna C4.BOR1;1c在Col-0中过量表达都能促进转基因植株的生长,提高地上部鲜重,主根增长。在突变体bor1-1中过量表达Bna C4.BOR1;1c,转基因植株提高了对缺硼的抗性,包括主根长、鲜重和及硼含量显著增加,但Bna C4.BOR1;1c的超表达不能互补nip5;1-1突变体。这些研究结果说明Bna C4.BOR1;1c与拟南芥BOR1基因有相同的生物学功能。4.利用RNAi干涉技术,创建甘蓝型油菜硼高效品种青油10号Bna C4.BOR1;1c基因的RNAi转基因株系。通过苗期营养液培养和成熟期土培试验,发现Bna C4.BOR1;1c不论在苗期还是成熟期都具有将根中的硼运往地上部的功能,特别是促进硼在成熟期花器官中的分配。此外,对RNAi干涉材料进行微观分析,并与硼高效品种青油10号相比较,发现RNAi干涉材料表现出典型的严重缺硼症状:花器官发育畸形,花药数少萎缩,变脆易断裂,柱头外露,下端异常褐化,木质化严重;花粉粒畸形、不饱满、表面粗糙,且花粉沟深陷等,最终导致花而不实,严重影响籽粒产量。说明Bna C4.BOR1;1c基因是油菜生殖生长和产量形成所必需的。5.采用q RT-PCR分析缺硼条件下Bna C4.BOR1;1c基因在两个高低效材料间不同时间点的表达情况,发现硼高效品种青油10号显著受缺硼诱导表达,且在QY10中表达量高于Westar10;同时我们发现QY10和Westar10在不同硼浓度处理下的表型和硼含量等都存在显著的差异并且低硼情况下青油10号的B含量显著高于硼低效品种Westar 10。QY10和Westar10中Bna C4.BOR1;1c的启动子序列存在两个In Del位点差异,其中在-478到-451 bp的位置,QY10存在27 bp插入。通过生物信息学分析27 bp的插入序列,发现其存在四个重要的顺式作用元件:ROOTMOTIFTAPOX、YACT、GATA BOX和I BOXCORE。因此Bna C4.BOR1;1c在硼高效和低效这两个材料中转录水平的差异很可能是它们启动子存在不同调控元件所导致的。