研究背景慢性肾脏病是一种以进行性肾功能恶化为特征的肾脏疾病。其中相当比例的患者最终进展为终末期肾功能衰竭而需要终生透析或肾移植来治疗。肾间质纤维化是肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同途径。在肾间质纤维化的发生发展过程中,细胞迁移发挥着重要的作用。最常见的是炎症细胞迁移浸润。目前又有研究表明,在细胞因子、氧自由基等损伤因子刺激下,肾脏固有细胞(肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、肾间质成纤维细胞等)活化为细胞外基质(ECM)生成细胞,细胞粘附力降低及向间充质细胞表型转变(α-SMA表达增加),从而使细胞的迁移能力增强,细胞发生病理性移位,脱离正常生理位置向间质迁移,促进肾间质纤维化。另外,在肾纤维化进展过程中,成纤维细胞转变为肌成纤维母细胞后,其迁移能力明显增强,在肾间质广泛浸润,进一步加重肾脏损伤。TGF-β1是一个促纤维化的因子。体外实验发现,TGF-β1刺激可引起肾小管上皮、系膜细胞及肾小球毛细血管内皮等肾脏固有细胞迁移能力增强。然而细胞迁移的具体机制尚不清楚。ELMO1是一个吞噬和细胞运动性蛋白。ELMO1与Dock180形成复合物,作为Racl的GEF,特异性激活Rac1,促进细胞迁移。研究发现,ELMO1与慢性肾脏病的发生发展密切相关。在肾间质纤维化模型—UUO大鼠中发现,ELMO1在肾脏组织中表达明显升高,且主要分布在近端肾小管上皮细胞中。TGF-β1刺激肾小管上皮细胞,ELMO1表达明显上升及细胞迁移增强。用抗Thy1.1(E30)抗体注射大鼠形成的慢性肾小球肾炎模型中,受损区的肾小球上皮细胞及浸润的间质细胞中ELMO1表达明显升高。过表达ELMO1的细胞能促进细胞外基质(ECM)分泌、减少细胞黏附分子的表达,抑制细胞之间的黏附及细胞向ECM粘附,增加细胞的活动度。这些研究提示：ELMO1通过多条途径(包括本研究关注之一：细胞迁移)共同参与了慢性肾脏病的发生。然而具体机制尚不清楚。最近研究发现,ELMO1的酪氨酸磷酸化在参与调控细胞迁移中起着重要作用。ELMO1可以被Src激酶家族成员Hck磷酸化,其中Y18、Y216、Y395,Y511F和Y720五个酪酸酸位点能被Hck明显磷酸化。抑制Src激酶活性及单点或多点突变ELMO1,细胞迁移减弱,尤其是4YF(Y18、Y216、Y395和Y511F)。但是ELMO1的酪氨酸磷酸化影响细胞迁移的具体机制尚不清楚。而我们的前期研究发现了一个与ELMO1相互作用的新分子-Nck-1。Nck-1由N端三个SH3结构域和一个C末端的SH2结构域组成。Nckl-SH2结构域可以结合活化的酪氨酸激酶受体和酪氨酸磷酸化的船屋蛋白(docking proteins),而Nck-1的SH3结构域可以结合许多调控细胞骨架运动的蛋白。目前大量研究发现,Nck-1通过SH2结构域接受细胞内、外酪氨酸磷酸激酶信号,再经SH3结构域将信号传递至Arp2/3复合物,调控细胞骨架重排,促进细胞迁移。PDGF刺激可引起PDGF受体(PDGFR)的第751位点的酪氨酸发生磷酸化,Nckl-SH2结构域与该位点结合,再通过其SH3结构域募集下游更多蛋白复合物,将信号传递至Arp2/3复合物,调控细胞骨架重排,促进细胞迁移。A36R是位于vaccinia病毒细胞表面的一个跨膜蛋白,与酪氨酸激酶Src相互作用后活化Src,活化的Src进一步磷酸化A36R第112位点的酪氨酸,A36R通过该位点与Nck-1的SH2结构域结合,从而通过Nck-1-WASP-Arp2/3复合物引起细胞骨架的重排,促进vaccinia病毒在宿主细胞内的传播。综上所述,衔接蛋白Nck-1可以通过其SH2结构域接受细胞内、外酪氨酸磷酸激酶信号,再通过其SH3结构域募集更多蛋白复合物,促进细胞迁移。我们前期工作发现了衔接蛋白Nck1-SH2结构域可以与ELMO1结合,鉴于ELMO1的酪氨酸磷酸化对细胞迁移起着重要作用以及Nck-1可以介导酪氨酸磷酸化信号促进细胞迁移,那么我们推测ELMO1可能通过其酪氨酸磷酸化位点与Nck-1相互作用促进细胞迁移。本研究拟通过如下实验验证上述假设：1、进一步验证ELMO1与Nck-1的相互作用。2、明确ELMO1与Nck-1的相互作用是否依赖于ELMO1的酪氨酸磷酸化,并确定哪些位点介导两者之间的相互作用。3、明确ELMO1-Nck-1的相互作用是否能促进细胞迁移。通过研究ELMO1与Nck-1的相互作用及其功能,为进一步研究ELMO1在慢性肾脏病中的致病机制提供了新的研究思路。实验方法1.细胞培养与转染HEK293T细胞来源于中国上海科学院细胞库,细胞培养在10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中,培养条件为37℃,95%空气,5%C02。无血清静置12h后,10μM SU6656刺激HEK293T细胞2h或者转染Myc-ELMOl质粒36小时后用0.1mM Pervanadate(PV)处理HEK293T细胞20min。按照Lipofectamine2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)说明书进行质粒转染或者siRNA干扰细胞。所有这些实验中,用空载体或者阴性siRNA来均衡不同样本间质粒溶度和siRNA的量。2.质粒构建人全长的Nck-1cDNA (NCBI收录号BC006403)扩增及克隆至pRecieverM11表达载体中。为了构建Flag-Nckl突变体：Nckl R308K,将Nck-1的SH2结构域中FLVRES序列中保守的精氨酸替换成赖氨酸。通过基于突变AATCC A→GACCCC(756-761)的PCR来构建RNAi-resistant Nck-1和R308K。GST-Nck1-SH2质粒构建：以人的Nck-1为模板,用PCR扩增出SH2结构域序列,连接至pGEX-4T-3表达载体上。根据文献构建Myc-ELMO1(WT),Myc-ELMO11-625, Myc-ELMO11-495, Myc-ELMO11-315, Myc-ELMO1532-727(△531)及以Myc-ELMO1质粒为模板突变Y18F, Y216F,Y395F,Y511F,3YF(18F, Y216F,Y395F),4YF (18F, Y216F, Y395F, Y511F)。人全长的Hck由广州复能基因公司构建。Flag-Dock180由Dr. Michiyuki Matsuda (Kyoto University, Kyoto, Japan)赠送。3. siRNA准备Nckl siRNA由中国上海吉玛基因公司设计合成。Nckl siRNA序列为：GCAGAAUAAUCCAUUAACUTT;阴性对照序：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT。4. GST pull down实验pGEX-4T-3质粒(GST), pGEX-Nck1-SH2质粒(GST-Nckl-SH2)转化感受态大肠杆菌BL-21,加入IPTG至0.6mM,37℃诱导4小时。按照说明书操作,用谷胱甘肽琼脂糖珠GSH-Sepharose4B beads (Amersham Biosciences, NJ, USA)纯化GST融合蛋白和GST-Nckl-SH2融合蛋白。PBS洗涤3次后,使用前存放于-80℃C。准备好细胞裂解液,15,000g离心15分钟,取上清与预清洗的谷胱甘肽琼脂糖珠(GST-conjugated Sepharose beads)在40C孵育1小时。5000g离心5分钟,取预清洗的细胞裂解液与GST或者GST-Nck-1-SH2共轭的谷胱甘肽琼脂糖珠在40C孵育3小时,5000g离心5分钟。与琼脂糖珠结合的蛋白用冰的补加有蛋白酶抑制剂Cocktail的PBS清洗3次。最后与琼脂糖珠结合的蛋白用SDS上样缓冲液煮沸5分钟,洗脱的蛋白经SDS-PAGE进行western blot检测。5.免疫印迹(Western blot)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation)不同处理的细胞用IP缓冲液(20mM Tris-HCl, pH7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,2mM Na3VO4,5mM NaF,1%(vol/vol) Triton X-100, and protease inhibitor mixture)在4℃裂解30分钟,12,000rpm离心20分钟,去除沉淀。上清用考马斯亮蓝G-250(Amresco, USA)检测蛋白溶度。等量的细胞裂解液加入所需抗体和protein A/G agarose beads (Roche)4℃共同孵育24小时。3000g离心5分钟,免疫沉淀物用IP buffer清洗5次,与2×SDS上样缓冲液混合,然后进行SDS-PAGE, western blot检测。6.细胞迁移实验细胞迁移实验根据操作说明说指导,使用8pm孔隙小室(BD Falcon).简单的步骤如下,细胞用含EDTA胰酶消化后用无血清DMEM培养基清洗1次。细胞再重悬于无血清DMEM培养基。在下室中加入0.7m110%胎牛血清高糖DMEM,上室中加入含5×104个细胞DMEM混悬液。细胞在37℃C培养箱中迁移12小时。用棉签擦拭小室上表面未迁移的细胞,小室底部迁移的细胞用甲醇固定15分钟后,用结晶紫溶液(0.5%in PBS)染色30分钟。在20倍显微镜下计数细胞,显微镜下随机取9个视野,迁移细胞的平均数作为每次实验结果。7.统计学处理所有数据均代表3次以上重复实验的结果,以均数±标准差表示,所有统计分析由统计软件SPSS13.0完成。当方差齐时,多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD,当方差不齐时使用Welch检验,两两比较采用Dennett’s T3。两样本均数的比较采用t检验。p<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1.明确ELMO1与Nck-1相互作用我们前期工作通过质谱分析发现了Nck-1的SH2结构域与ELMO1结合。为了进一步明确ELMO1与Nck-1相互作用,在体外实验中,首先我们检测外源性的ELMO1与Nck-1是否相互作用,如所预测的结果,在共转染Myc-ELMO1与Flag-Nckl的293T细胞中,用抗Myc标签抗体免疫共沉淀,Western blot能检测到外源性Flag-Nckl,而用同型对照IgG抗体免疫共沉淀,Western blot不能检测到外源性Flag-Nckl;反过来,用抗Flag标签抗体免疫共沉淀,Western blot能检测到外源性的Myc-ELMO1。接下来我们进一步检测内源性的ELMO1与Nck-1相互作用。结果发现,无论用ELMO1抗体或Nck-1抗体免疫共沉淀都能检测到两者相互作用。因为之前的研究发现ELMO1的C端532-727氨基酸能与Dock180结合,Dock180又能与Nck-2结合。为了验证Dock180是否参与了ELMO1与Nck-1的相互作用,我们根据文献构建Myc-ELMO1突变体：ELMO1532-727(A531)和ELMO11-625(T625)。WT, T625,△531分别转染293T细胞。GST pull down实验显示T625与Nck1-SH2结合与WT一样多,而未能检测到Nckl-SH2与△531的结合。这些结果表明Dock180未介导ELMO1与Nck-1的相互作用。进一步截短ELMO1发现,截短体ELMO11-495仍然能够与Nckl-SH2结合,而未能检测到截短体ELMO11-315与Nckl-SH2结合,提示ELMO1的N端495个氨基酸介导与Nck1-SH2的相互作用。2. ELMO1与Nck-1相互作用依赖于ELMO1的酪氨酸磷酸化SH2结构域可以与酪氨酸磷酸化的蛋白结合,因此我们研究Nckl-SH2与ELMO1相互作用是否与ELMO1酪氨酸磷酸化有关。首先,我们用广谱酪氨酸磷酸酶抑制剂P V (pervanadate)处理过表达Myc-ELMO1的HEK293T细胞,用4G10抗体检测到PV处理的ELMO1磷酸化水平明显增(p<0.05),同时GST-Pull down实验发现ELMO1与Nckl-SH2结合明显增强p<0.05)。接下来,我们检测正常的HEK293T中内源性的ELMO1酪氨酸磷酸化水平,免疫沉淀结果发现存在有ELMO1的酪氨酸磷酸化。新近的研究发现,ELMO1可以被Src激酶家族磷酸化,所以我们用Src激酶家族抑制剂SU6656抑制细胞内源性Src激酶家族,结果发现SU6656处理组中Src的磷酸化明显下降,与正常组相比下降约92%p<0.05),与此同时,ELMO1磷酸化水平明显下降,与正常组相比下降约45%<0.05)。Hck属于Src激酶家族,过表达Hck激酶,ELMO1酪氨酸磷酸化水平明显升高p<0.05),同时我们发现ELMO1与Nck1-SH2结合也增强(p<0.05)。研究已经鉴定出ELMO1Y18,Y216,Y395, Y511和Y720五个位点的酪氨酸能被Hck激酶明显磷酸化。为了确定这些酪氨酸残基位点是否对ELMO1与Nckl-SH2结合起着重要作用,首先我们构建单个酪氨酸位点突变质粒Y18F,Y216F, Y395F, Y511F。GST-pull down实验中发现Y18F, Y216F, Y395F, Y511F与Nckl-SH2结合,与WT相比明显下降(p<0.05)；接着我们进一步突变ELMO1中3个酪氨酸残基18,216,395(3YF)和4个酪氨酸残基18,216,395,511(4YF),GST-Pull down实验发现4YF能进一步减弱与Nckl-SH2结合,与WT相比下降约90%p<0.05)。为了进一步证实上述结果,WT ELMO1或4YF与HA-Hck和Flag-Nck-1共转染于293T细胞中,结果发现4YF的磷酸化水平明显下降,与WT相比下降约68%p<0.05),4YF与Nck-1结合也下降,与WT相比下降约30%(p<0.05)。研究报道,Nckl-R308K突变能破坏SH2结构域与酪氨酸磷酸化残基结合。我们的研究发现在共转染WT Nck-1或者R308K与ELMO1的293T细胞中,ELMO1与R308K结合比WT Nck-1明显下降p<0.05),提示了ELMO1的酪氨酸磷酸化位点主要与Nckl-SH2结构域结合。3. ELMO1与Nck-1相互作用促进细胞迁移研究发现,ELMO1的酪氨酸磷酸化对ELMOl/Dock180复合物诱导的细胞迁移起着重要作用。我们在293T细胞中发现,WT ELMO1能明显促进ELMO1-Dock180诱导的细胞迁移(p<0.05),突变体Y18F, Y216F, Y395F, Y511F能减少细胞迁移(P<0.05),联合突变四个位点(4YF)能进一步减少细胞迁移p<0.05)。我们接着用WT Nck-1或者R308K Nck-1来分析ELMO1与Nck-1之间的相互作用对细胞迁移的影响。本研究发现,共转染ELMO1-Dock180能促进细胞迁移(p<0.05),共转染Nck-1-ELMO1-Dock180能进一步促进ELMO1-Dock180介导的细胞迁移(p<0.05),而共转染R308K-ELMO1-Dock180却不能增强ELMO1-Dock180介导的细胞迁移(p>0.05)。接下来,我们用Nck-1siRNA敲除内源性的Nck-1,减少内源性的Nckl-ELMO1结合,观察细胞迁移是否下降。沉默内源性的Nck-1细胞迁移明显下降,与阴性对照组(正常组)相比下降约50%p<0.05),重新表达siRNA抵抗的WT Nck-1能恢复细胞的迁移(p<0.05),而R308K却不能恢复细胞迁移p>0.05)。这些结果说明了Nck1-SH2结构域的完整性对于传导ELMO1的酪氨酸磷酸化信号及其促进细胞迁移起着重要的作用。结论1. ELMO1与Nck-1之间存在相互作用。2. ELMO1存在酪氨酸磷酸化。3. ELMO1与Nck-1的相互作用依赖ELMO1的酪氨酸磷酸化。4.Hck激酶依赖的Y18,Y216,Y395和Y511酪氨酸磷酸化位点对于ELMO1与Nck-1的相互作用起着重要作用。5. ELMO1与Nck-1的相互作用促进细胞迁移。