背景与目的:颅咽管瘤（craniopharyngioma,CP）为颅内良性肿瘤,其包括两种病理亚型即牙釉质型颅咽管瘤（adamantinomatous craniopharyngioma,ACP）和乳头型颅咽管瘤（papillary craniopharyngioma,PCP）。ACP是CP最主要的病理亚型,约占CP总数的90%,其可见于成人及儿童病人。目前CP的主流治疗方式仍然是手术全切除。尽管CP为生物学良性肿瘤,手术全切具有可治愈性,但由于其位置毗邻下丘脑-垂体轴,手术全切造成下丘脑损伤率高达68%。下丘脑肥胖是导致CP病人生活质量下降和生存时间缩短的关键因素。在儿童CP病人中已有大量证据表明下丘脑损伤与术后下丘脑肥胖密切相关,但在成人CP病人中,下丘脑损伤与术后下丘脑肥胖的相关性还需进一步确认,从而明确防止或减少下丘脑损伤是治疗CP病人的关键问题。指头样侵袭结构作为ACP的特征性病理结构之一,常见于肿瘤与周围下丘脑组织接触的标本中,表现为肿瘤呈“指头样”延伸至周围下丘脑脑组织中,是导致病人术后下丘脑损伤的重要原因。然而,目前导致ACP指头样侵袭结构形成的机制尚不明确,临床上也缺乏有效的干预手段。课题组前期和既往相关研究表明ACP周围脑组织的肿瘤微环境和肿瘤内whorl-like细胞簇可能在其指头样侵袭结构的形成中具有重要作用。本课题拟首先明确成人CP病人下丘脑损伤是否是术后下丘脑肥胖的独立危险因素,旨在强调防止或减少下丘脑损伤对降低CP病人术后下丘脑肥胖的发生率及改善预后至关重要。然后通过整合单细胞核和空间转录组测序从肿瘤周围下丘脑组中的肿瘤微环境和肿瘤内whorl-like细胞簇两个角度探索ACP指头样侵袭结构形成致下丘脑损伤的潜在机制,旨在为临床干预ACP指头样侵袭结构的形成,进而在全切肿瘤的同时减少甚至杜绝下丘脑损伤,最终提高病人预后提供潜在的药物作用靶点。材料与方法1.回顾性分析本中心于2009年12月到2021年10月行手术切除的CP病人的病例资料,纳入年龄大于18岁,有完整术前、术后及随访资料且为第一次手术的CP病人。分别根据Puget、Muller和Roth等人的基于磁共振的下丘脑损伤分级/评分以及我们课题组前期制定的基于内镜下观察的下丘脑损伤模式评估每个病人的术后下丘脑损伤状况。本部分研究的主要观察指标为具有临床意义的体重增加（≥5%）和下丘脑肥胖（体重指数大于28.0 kg/m~2,且手术前1年内或术后6个月内体重指数增加≥2 kg/m~2）。我们首先描绘每个时间节点（手术前、术后6个月、术后1年及最近1次随访）的体重、体重指数及肥胖率的变化,然后通过单因素、多因素逻辑回归分析明确以上基于影像或者内镜下观察的下丘脑损伤评估是否是术后体重增加或下丘脑肥胖的独立危险因素。2.本部分研究收集3例经病理证实的以指头样结构侵袭下丘脑的ACP冻存标本,总共6个样本（每例肿瘤2个样本,一例靠近下丘脑,一例远离下丘脑）行单细胞核测序。其中1例肿瘤分别取靠近下丘脑和远离下丘脑的石蜡包埋标本行空间转录组测序（各一块切片）。此外还选择另外两例ACP的石蜡包埋切片行空间转录组测序（1例靠近下丘脑,1例远离下丘脑,各一块切片）,即共有4块石蜡包埋ACP组织行空间转录组测序（2块靠近下丘脑组织和2块远离下丘脑组织）。我们首先通过单细胞核测序分析揭示以指头样结构侵袭下丘脑的ACP组织的细胞类型,然后提取上皮细胞亚群和神经元进一步细分亚群,结合空间转录组测序进一步阐明上皮细胞和神经元的分子特征,并通过细胞通讯分析探索他们潜在的相互作用。3.本部分研究探索肿瘤内部whorl-like细胞簇驱动ACP指头样侵袭结构形成的作用机制。我们首先收集35例以指头样结构侵袭下丘脑的ACP样本,同一肿瘤样本分别在肿瘤与下丘脑融合部位和肿瘤与下丘脑有清晰界面的区域留取样本行组织学检查,查看两者间的病理结构差异,然后通过相关性分析明确指头样突起的深度与whorl-like细胞簇大小的相关性。此外,我们提取上部分研究中确定的β-catenin核内/胞质聚集的细胞群,进一步细分亚群,并结合空间转录组测序、免疫荧光和荧光原位杂交检查,明确各亚群的空间分布,进而明确指头样侵袭结构中whorl-like细胞簇的细胞组成。随后通过基因集变异分析对各亚群进行信号通路富集分析明确各亚群的分子功能及所富集的通路,并应用免疫荧光对其结果进行验证。结果:1.第一部分研究共纳入96例成人颅咽管瘤病人,其中47例（49.0%）和18例（18.8%）分别在最近1次随访时发生有临床意义的体重增加（≥5%）和下丘脑肥胖。成人CP病人体重显著增加出现在术后6个月内,随后体重基本保持在稳定的状态。Muller等人磁共振损伤分级中的Grade2和Roth下丘脑损伤评分中更高的下丘脑病损评分都与术后有临床意义的体重增加（P=0.005和P=0.002）和下丘脑肥胖显著相关（P=0.001和P=0.008）。此外,课题组前期制定的基于内镜下观察的下丘脑损伤模式与术后有临床意义的体重增加显著相关（P=0.008）。2.本部分研究中,我们首先揭露了以指头样结构侵袭下丘脑的ACP组织中有12个细胞类型,包括上皮细胞、NK＆T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、浆细胞、树突细胞、内皮细胞、成纤维细胞、神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。其次,我们首次全面地揭示了ACP上皮细胞的异质性,其包括6群不同分子功能的上皮细胞亚群,其中EC1群细胞数最多,代表大部分的肿瘤细胞,EC2群为经受矿化/钙化的细胞群,EC3代表β-catenin核内/胞质聚集的细胞群,EC4群为具有神经元属性的细胞群,EC5群为增殖最活跃的细胞群,EC6群为可能参与抗微生物免疫反应的细胞群。此外,在以指头样结构侵袭下丘脑的ACP组织中发现一群新生的抑制性神经元,而在与下丘脑之间无指头样侵袭关系的ACP周围胶质增生组织无抑制性神经元存在。通过免疫组化比较以指头样结构侵袭下丘脑的ACP和与下丘脑之间无指头样侵袭关系的ACP样本中GABA代谢相关分子GABA、ABAT、GAD67和GAD65表达差异,我们发现GABA和ABAT在以指头样结构侵袭下丘脑的ACP中显著增高,而GAD67和GAD65在两者间无显著差异,表明以指头样结构侵袭下丘脑的ACP中GABA代谢明显增强,且GABA主要来自周围下丘脑组织。同时,我们通过细胞通讯分析发现NGR1/NGR2/NGR3-ERBB4配受体对在肿瘤细胞对神经元的作用中活性最强,进一步空间转录组提示NGR1/NGR2-ERBB4配受体共表达在以指头样结构侵袭下丘脑的ACP组织ST切片中明显增多。3.本部分研究中,我们发现在同一累及下丘脑的ACP中,指头样侵袭结构中均有whorl-like细胞簇,而与下丘脑接触但无指头样突起的标本中均无whorl-like细胞簇,但星形网状结构和栅栏样结构均无明显差异。此外,指头样突起的深度与whorl-like细胞簇的大小呈正相关,以上结果提示whorl-like细胞簇的膨胀性生长可能驱动了ACP指头样侵袭结构的形成。进一步,我们揭示了β-catenin核内/胞质聚集细胞可以分为3群不同分子特征的细胞亚群,即GRM8+、CD133+和RSPO2+细胞群。Whorl-like细胞簇由GRM8+和CD133+细胞组成,GRM8+与β-catenin核内聚集细胞共定位,CD133+细胞与β-catenin胞质聚集细胞共定位,它们相互毗邻,而RSPO2+细胞群主要位于湿角蛋白周围。CD133+细胞增殖活跃,且IL-6-JAK2-STAT3信号通路在其中被特异性激活,而GRM8+细胞具有细胞衰老相关分泌表型。结论:1.下丘脑损伤是成人CP病人术后出现下丘脑肥胖的独立危险因素。然而,下丘脑肥胖目前仍缺乏有效的治疗手段,因此如何防止或减少病人下丘脑损伤是成功治疗CP的关键。2.以指头样结构侵袭下丘脑的ACP由多种细胞成分组成。其中上皮细胞具有显著的异质性,包含6种具有不同分子功能的细胞亚群。而ACP周围下丘脑组织中的神经元主要为一群具有抑制性神经元属性的新生神经元。此外,肿瘤细胞与肿瘤周围神经元之间的相互作用可能在ACP以指头样结构侵袭下丘脑中起重要作用。3.整合单细胞核测序、空间转录组测序和免疫染色,我们初步认为whorl-like细胞簇中GRM8+细胞可能分泌IL-6,后者通过旁分泌方式作用于CD133+细胞,激活JAK2-STAT3信号通路,促进CD133+细胞增殖,使whorl-like细胞簇膨胀性生长,进而驱动ACP指头样侵袭结构的形成。