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蛋白质/多糖自组装纳米粒子由于其安全无毒、制备简单、表面易修饰、载药量高、控释性能好等优势,在药物递送方面越来越受关注。但这些纳米粒子只能通过渗透-保留作用被动积累于肿瘤组织,为进一步提高药物疗效、降低毒副性,用靶向配体修饰纳米粒子,构建主动靶向蛋白质/多糖纳米载药体系,成为研究热点。本文选用低密度脂蛋白(LDL)和羧甲基纤维素钠(CMC)作为原料,通过绿色简单的自组装法制备新型LDL/CMC纳米凝胶。以DOX为模型药物,研究LDL/CMC纳米凝胶的载药和体外缓释特性,并评价其体外抗癌活性。在此基础上,为提高DOX-LDL/CMC纳米凝胶抗肿瘤疗效,通过酯化反应将叶酸与羧甲基纤维素钠偶联(FA-CMC),采用加热法和离子交联法优化制备叶酸主动靶向载药纳米凝胶(DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL),研究其理化特性,并对体外释放行为和细胞靶向性进行探讨。研究发现,这种新型靶向载药纳米粒子不但能实现DOX的p H响应性释放,还具有叶酸靶向功能,能促进DOX的肿瘤靶向递送,增加肿瘤细胞的摄取,提高药物疗效,具有良好的应用前景。主要研究内容和结果如下:1.以鸡蛋低密度脂蛋白(LDL)和羧甲基纤维素钠(CMC)为原料,通过绿色简单的自组装法制备LDL/CMC纳米凝胶。探讨质量比、p H、加热对LDL/CMC纳米粒子的影响,DLS和TEM结果表明,最佳LDL/CMC纳米粒子是平均粒径为90 nm的球形纳米粒子,其多分散系数为0.3,δ-电位为-35 m V。LDL与CMC主要靠静电相互作用和疏水相互作用自组装形成LDL/CMC纳米粒子。LDL/CMC纳米粒子很可能具有核壳结构,主要以CMC为壳,致使LDL/CMC纳米粒子在p H 3.0~10.0范围内不发生聚集或解离,粒径稳定。此外,在4℃条件下纳米粒子在等渗溶液中可保存数月。其冻干粉末样品可重新水合分散,纳米粒子基本性质不发生显著变化。2.以阿霉素(DOX)作为模型药物,对DOX-LDL/CMC纳米凝胶载药、体外释放、细胞毒性及细胞摄取进行研究。在静电和疏水相互作用下,LDL/CMC纳米粒子实现了对阿霉素的高效负载。当DOX浓度为100μg/m L时,DOX-LDL/CMC的载药率最高98.219%,粒径最小123.7 nm,且δ-电位为-38.2m V。另外,体外释放实验表明DOX-LDL/CMC纳米凝胶中DOX的释放具有p H响应性,在生理条件下(p H 7.4)释放缓慢,而在弱酸性条件下(p H 6.2)释放加快。此外,DOX-LDL/CMC纳米粒子能有效被肿瘤细胞摄取而杀死细胞。MTT实验结果表明,DOX-LDL/CMC纳米粒子对He La和Hep G2细胞的半抑制浓度IC50分别为游离DOX的2.45和1.72倍,DOX被LDL/CMC纳米粒子包载后细胞毒性显著降低。通过CLSM和FCM研究可知,与裸药DOX相比,DOX-LDL/CMC纳米粒子通过较慢的内吞作用进入Hep G2细胞,红色荧光强度低,DOX的蓄积少,从而使细胞毒性降低。3.利用偶联剂(EDC)将叶酸与羧甲基纤维素钠偶联,制得偶联物FA-CMC。紫外光谱、红外光谱、1H-NMR核磁共振光谱和XPS能谱结果均证明了FA与CMC已成功偶联。XRD和DSC分析表明偶联前后CMC的晶型结构和热特性均存在一定差异。当FA与CMC质量比为3:1时,偶联比最高达到4.1%。探索制备靶向纳米粒子的最佳条件,实验结果表明,加热法制备的最佳靶向纳米凝胶(FA-CMC/LDL),其平均粒径为124 nm,多分散系数为0.3,δ-电位为-35 m V。离子交联法制备的最佳靶向纳米凝胶(Ca2+-FA-CMC/LDL),其平均粒径为152nm,多分散系数为0.26,δ-电位为-30 m V。DLS和TEM分析结果显示,与FA-CMC/LDL纳米粒子相比,Ca2+-FA-CMC/LDL纳米粒子更大,分散性更好,形态更加规则。此外,在4℃条件下储藏90天后,这两种纳米粒子均未出现沉淀,稳定性较好。4.选用最佳的靶向纳米凝胶FA-CMC/LDL和Ca2+-FA-CMC/LDL负载DOX,研究其载药和体外释放特性,并对细胞靶向性进行评价。当DOX浓度为80μg/m L时,DOX-FA-CMC/LDL纳米粒子载药率高达96.576%,其平均粒径为136.07 nm,多分散系数为0.431,δ-电位为-28.50 m V;而对于DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL纳米粒子,其平均粒径为196.93 nm,多分散系数为0.278,δ-电位为-24.30 m V,载药率为97.245%。另外,体外释放实验表明,DOX-FA-CMC/LDL纳米粒子和Ca2+-FA-CMC/LDL纳米粒子对DOX的释放均具有p H响应性,且DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL纳米粒子的控释效果更好。此外,MTT实验结果表明,对于FR阳性KB细胞,DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL的细胞毒性明显高于DOX-LDL/CMC。而对于FR阴性A549细胞,游离DOX的细胞毒性大于三种载药纳米粒子(DOX-LDL/CMC,DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL)。CLSM和FCM研究结果表明,纳米粒子经叶酸靶向修饰后能促进FR阳性KB细胞的摄取,靶向纳米粒子的摄取量是非靶向纳米粒子的1.3倍。最后,通过探究外源叶酸对细胞毒性和细胞摄取的影响,初步验证了叶酸靶向载药纳米粒子DOX-FA-CMC/LDL和DOX-Ca2+-FA-CMC/LDL可通过叶酸受体介导靶向富集于叶酸受体高表达的肿瘤细胞内,从而增强抗肿瘤作用。