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第一部分Thy-1肾炎病变和sublytic C5b-9诱导GMCs增殖、ECM分泌及TSP-1、TGF-β1合成的作用目的:检查Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis, Thy-1N)大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells, GMCs)病变和体外用亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)复合物诱导GMCs增殖、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的合成情况。方法:首先,复制大鼠Thy-1N模型,定期用real-time PCR和Western blot方法检查其肾组织中细胞增殖指标,即细胞周期蛋白D2(cyclin D2)和增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)及ECM指标,即纤维连接蛋白(fibronectin,FN)和IV型胶原蛋白(collagen IV)和上述两种细胞因子(TSP-1和TGF-β1)的表达水平。同时,使用BrdU掺入法、光镜及电镜观察大鼠肾小球细胞的增殖情况。此外,体外培养大鼠GMCs,进行不同分组处理后再给予sublytic C5b-9刺激,分别检查受刺激的GMCs合成cyclin D2、PCNA、FN、collagen IV、TSP-1和TGF-β1 mRNA丰度及蛋白水平。另用ELISA法检测培养上清中总TGF-β1和活化的TGF-β1含量,并用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法(3H-thymidine incorporation,3H-TdR)检查GMCs的增殖情况。结果:大鼠Thy-1N病变18h时,肾组织中cyclin D2、PCNA表达和肾内BrdU阳性细胞数均开始升高,实验3d时,除了上述指标升高外,肾组织中FN、collagen IV和TSP-1、TGF-β1的合成亦显著升高,7d时这些指标的升高更为明显。另形态学观察还发现,实验3d时,GMCs数量和ECM分泌均明显增多,7d时增加更为显著。体外实验中,大鼠GMCs在sublytic C5b-9刺激后18h,其cyclin D2、PCNA、FN和collagen IV表达及细胞增殖水平均显增高。同时,TSP-1和TGF-β1 mRNA及蛋白表达(包括活化的TGF-β1含量)也明显上升。结论:Thy-1N大鼠肾小球病变存在早期增殖和继发增生的病理改变。体外用sublytic C5b-9刺激GMCs能够诱导其细胞增殖、ECM分泌和细胞因子(TSP-1和TGF-β1)的合成。第二部分体外沉默TSP-1基因和抑制TGF-β1活化对sublytic C5b-9促进GMCs增殖和ECM分泌的影响目的:研究沉默TSP-1基因对于sublytic C5b-9复合物促进GMCs增殖和ECM分泌的影响,并探讨TSP-1与TGF-β1两种细胞因子之间的关系。方法:设计合成针对TSP-1基因4个靶点的小干涉RNA(small interference RNA, siRNA),筛选沉默效率最佳的TSP-1 siRNA。将TSP-1 siRNA转染体外培养的大鼠GMCs后再给予sublytic C5b-9刺激。以real-time PCR和Western blot检查TSP-1、TGF-β1、cyclin D2、PCNA、FN及collagen IV mRNA丰度和蛋白表达情况。另用ELISA法测定培养上清中总TGF-β1和活化TGF-β1的含量。同时,用3H-TdR法检查GMCs的增殖水平。除此之外,应用人工合成的TSP-1封闭肽段(GGWSHW)和TGF-β1中和抗体处理培养的大鼠GMCs,研究TSP-1和TGF-β1在sublytic C5b-9诱导的GMCs增殖和ECM分泌中的作用及其相互关系。结果:TSP-1 siRNA转染大鼠GMCs后,在沉默TSP-1基因表达的同时,能明显抑制由sublytic C5b-9诱导的GMCs增殖和细胞外基质(FN和collagen IV)的生成。另用TSP-1封闭肽段(GGWSHW)处理大鼠的GMCs后亦能显著抑制由sublytic C5b-9诱导的TGF-β1的活化,并减轻GMCs增殖和FN、collagen IV的产生。此外,用TGF-β1中和抗体处理GMCs后也能明显抑制由sublytic C5b-9引发的GMCs增殖和ECM(FN、collagen IV)的分泌。结论:用TSP-1 siRNA沉默GMCs中的TSP-1基因表达能够抑制由sublytic C5b-9刺激诱导的GMCs增殖和ECM分泌,而sublytic C5b-9促进GMCs增殖和ECM分泌的机制可能与其诱导的TSP-1合成增加且活化TGF-β1有一定的关系。第三部分体内关闭TSP-1基因对Thy-1肾炎病变和尿蛋白分泌的抑制效应目的:探讨用TSP-1 siRNA沉默大鼠肾组织内TSP-1基因对大鼠Thy-1肾炎(Thy-1N)肾组织病变和尿蛋白分泌的抑制作用。方法:应用肾动脉灌注加电导入方法,将TSP-1 siRNA表达质粒导入大鼠肾组织,再注射抗胸腺细胞血清(anti-thymocyte serum,ATS)复制大鼠Thy-1N。分别取ATS注射后18h、3d和7d时的大鼠肾组织,以real-time PCR、Western blot和免疫组化方法检查大鼠肾组织中TSP-1、TGF-β1、cyclin D2、PCNA、FN和collagen IV mRNA和蛋白的表达水平,同时应用ELISA法测定大鼠尿液中总TGF-β1和活化TGF-β1的含量,并采用BrdU掺入法观察各组大鼠肾小球细胞的增殖情况。此外,应用光镜和电镜检查大鼠肾组织病理学改变,并用生化方法测定各组大鼠24h尿蛋白的变化。结果:将TSP-1 siRNA质粒导入大鼠肾组织后再复制Thy-1N,定期取标本检查发现,TSP-1 siRNA+Thy-1N组,其肾组织中的TSP-1基因表达显著低于Thy-1N模型组,大鼠尿液中活化的TGF-β1含量也显著降低。另肾组织中的细胞周期蛋白(cyclin D2)、细胞增殖核抗原(PCNA)和细胞外基质(FN和collagen IV)表达水平明显下调。此外,BrdU掺入实验和形态学观察(光镜和电镜)还发现,用TSP-1 siRNA处理的Thy-1N大鼠(TSP-1 siRNA+Thy-1N组),其发病后的肾小球内GMCs增生及ECM积聚显著减轻,尿蛋白分泌也明显减少。结论:沉默大鼠肾组织内TSP-1基因再复制Thy-1N模型,不仅能够明显抑制Thy-1N大鼠肾组织中TGF-β1的活化,而且还能减少肾小球系膜细胞(GMCs)的增生和细胞外基质(ECM),如FN和collagen IV的分泌及蛋白尿的产生。