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背景:血管紧张素II(Angiotensin II,AngII)诱导的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell,VSMC)异常增殖、迁移和表型转化,是高血压、动脉粥样硬化等血管重构性疾病发生发展的重要病理性基础。最近有文献报道,AngII诱导的VSMC增殖和迁移改变与激活NF-κB途径上调缝隙连接蛋白43(Connexin43,Cx43)表达有关。中药有效成分吴茱萸次碱(Rutaecarpine,Rut)作为一种降压药物被发现有抑制血管重构效应。本课题组前期研究发现,Rut可抑制Ox-LDL诱导的VSMC增殖,其机制与激活辣椒素受体(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)抑制Cx43的表达有关。近来,AngII诱导的VSMC衰老在各种血管重构性疾病中的作用也引起广泛关注,其机制与下调长寿蛋白SIRT1表达有关。我们前期还发现,Rut可抑制高糖诱导的内皮细胞衰老,其机制与激活TRPV1上调SIRT1的表达有关。目的:探究吴茱萸次碱对AngII诱导的VSMC增殖、迁移和表型改变的影响及其机制是否涉及激活TRPV1抑制Cx43表达升高,并进一步探讨吴茱萸次碱是否通过TRPV1/SIRT1途径抑制VSMC衰老。方法:(1)原代VSMC的培养采用组织块贴壁法,免疫细胞化学法鉴定平滑肌标志蛋白α-SMA,取传代后的3~8代用于实验。(2)Rut对AngII诱导的VSMC增殖、迁移和表型转化的影响:AngII(1μmol/L)孵育VSMC 24 h,预先用不同浓度的Rut(0.3μmol/L,1μmol/L,3μmol/L)处理10 min,应用TRPV1竞争性拮抗剂Capsazepine(CAPZ,10μmol/L)探究TRPV1是否介导Rut的效应。细胞增殖指标:CCK-8和EdU检测细胞活力和增殖细胞数;流式细胞术检测细胞周期分布,Western blot检测细胞周期蛋白Cyclin D1;细胞迁移指标:划痕愈合实验和Transwell小室;表型转换指标:Western blot检测收缩表型标记蛋白α-SMA、Calponin的水平。Western blot检测VSMC中Cx43表达,运用细胞浆、核分离技术提取检测NF-κB亚基P65的水平,免疫细胞化学方法判断P65核转位情况。(3)Rut对AngII诱导的VSMC衰老的影响:AngII(1μmol/L)孵育VSMC72 h诱导VSMC衰老,Rut及CAPZ的处理及剂量同上。荧光探针DCFH-DA法检测ROS生成,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况;Western blot检测蛋白SIRT1,P53,P21的表达。Western blot检测磷酸化AMPK水平,应用AMPK阻断剂Compound C(1μmol/L)判断Rut是否通过激活AMPK上调SIRT1的表达。结果:Rut可抑制AngII诱导的VSMC增殖,表现为抑制VSMC的DNA合成及细胞活力,减少增殖期(S+G2/M)的细胞比例及Cyclin D1的表达。划痕愈合实验及Transwell小室结果显示Rut可呈剂量依赖性的抑制AngII诱导的VSMC迁移。Rut还可抑制AngII诱导的VSMC表型转化,部分恢复收缩型标志蛋白a-SMA和Calponin水平。Rut抗VSMC增殖、迁移和表型转换的效应均可被CAPZ部分阻断。Western blot结果表明,Rut可显著抑制AngII诱导的Cx43表达上调;AngII孵育VSMC 4 h即可升高核蛋白中P65水平,降低胞浆P65水平,不同浓度的Rut可抑制P65的核转位,CAPZ可取消Rut的效应。免疫细胞化学结果也显示,Rut可抑制AngII诱导的P65入核。Rut还可抑制AngII诱导的VSMC衰老:β-半乳糖苷酶染色结果发现,Ang II可明显增加平滑肌中衰老细胞数量,Rut呈剂量依赖性降低衰老细胞百分率,CAPZ可取消其作用。ROS荧光强度检测中,发现Rut可抑制AngII诱导的细胞内ROS生成;Western blot结果表明,Rut可显著恢复AngII诱导的SIRT1表达下调,抑制衰老相关蛋白P53、P21的表达上调,预先给予CAPZ可取消Rut的作用。进一步研究发现,Ang II孵育VSMC能明显抑制AMPK磷酸化,预先给与Rut可恢复AMPK磷酸化,该效应可被CAPZ所阻断。预先加入AMPK阻断剂Compound C可取消Rut上调SIRT1表达的作用。结论:吴茱萸次碱可抑制AngII诱导的VSMC增殖、迁移和表型转化,其机制与通过TRPV1/NF-κB途径,抑制Cx43表达上调有关。此外,吴茱萸次碱可抑制AngII诱导的VSMC衰老,其机制与激活TRPV1/AMPK/SIRT1途径,抑制衰老相关蛋白P53,P21的表达有关。