先天性气管狭窄或闭锁、肺部恶性肿瘤使气管的结构和功能造成严重损伤，需外科重建。但异种移植无法避免排斥反应，需终生应用免疫抑制剂，增加了感染及患肿瘤的危险性。如能使用气管干细胞移植，重建完整的气管上皮，则给上述患者的治疗带来希望。　　 我们的研究组利用5-FU制作了气管的损伤、修复模型。Oct3/4、Nanog和Sox2在正常的支气管上皮为阴性表达。在5-FU处理之后，正常的增殖期气管上皮脱落，仅有少量GO期细胞保留在基底膜上，此时出现Oct3/4、Nanog和Sox2的阳性表达。随后，Oct3/4、Nanog和Sox2阳性的细胞逐渐增多。当细胞分化为纤毛细胞、粘液细胞或基底细胞时，重建了假复层纤毛柱状上皮，而Oct3/4、Nanog和Sox2阳性细胞逐渐减少，最终消失。我们认为体细胞Oct3/4、Nanog和Sox2由阴变阳，可能发生了再编程，而后干细胞分化为纤毛细胞、粘液细胞或基底细胞，此时Oct3/4、Nanog和Sox2由阳变阴，再现了干细胞分化过程。并提出Oct3/4、Nanog和Sox2为气管干细胞的标志物，那么为什么在损伤修复过程中出现有规律的变化呢？进一步的研究证明，在5-FU处理后，体细胞Oct3/4、Nanog和Sox2的DNA启动子发生去甲基化，组蛋白乙酰化，染色质重塑，这些已在大鼠及人支气管器官实验中得到证明。本研究观察经5-FU处理后，富集分离人支气管上皮细胞株中的干细胞，并解析干细胞的生物学特点。　　 材料和方法：　　 一、材料与试剂　　 人支气管上皮细胞株HBE由本实验室培养传代，实验中所用为生长状况良好的细胞。细胞培养液为含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，培养条件为37℃、含5%CO2的细胞培养箱内。BALB/c Nu裸鼠，雄性5～6周，16～18克，购自上海茂生生物科技发展有限公司。无支原体胎牛血清、RPMI-1640培养基、0.25%胰蛋白酶、MTT、5-FU、Hoechst33342、Verapamil、PI、Giemsa染色液、Oct3/4单克隆抗体、Sox2单克隆抗体、P63单克隆抗体、β-catenin单克隆抗体、Alpha fetoprotein单克隆抗体、人肌动蛋白actin(SM)单克隆抗体、人微管蛋白Ⅲ单克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒、4，6-diamidino-2-phenylindole、TRITC标记的山羊抗兔IgG、TRITC标记的兔抗山羊IgG、TRITC标记的山羊抗小鼠IgG、EGF、bFGF、胰岛素、ECL化学发光试剂盒、Western细胞裂解液、考马斯亮蓝。　　 二、方法　　 1、MTT实验　　 将单个细胞悬液接种于96孔板中，每孔含103个细胞，培养24h，空白孔和对照孔分别加入200ul培养基，干预孔加入化疗药物和培养基，继续培养至干预后的相应时间点进行OD值的测定。每孔加入MTT溶液继续培养4h，加入DMSO，490nm波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的空白孔做对照。计算抑制率，绘制细胞生长曲线。　　 2、流式细胞仪分选SP细胞　　 消化细胞成单细胞悬液，调整细胞密度至1×106/mL，待分选细胞分两组处理：一组避光加入终浓度为5μg/ml Hoechst33342，另一组在避光加入终浓度为5μg/mlHoechst33342的同时，加入50μmol/L的维拉帕米(verapamil)作为对照。避光37℃孵育90min。孵育过程中每15min要充分混匀细胞。90min后，细胞4℃离心，1000rpm离心10min，重悬于含2% FBS的冰PBS中，加入终浓度为2μg/ml的PI，标记死细胞。流式细胞仪分选SP细胞：Hoechst33342染料在350 nm处被激发，发射光蓝光424nm/BP44，红光660nm/BP20。　　 3、细胞免疫荧光　　 将细胞接种于24孔板中培养生长。贴壁后按40μg/ml的浓度加入5-FU，24 h后测免疫荧光。4%多聚甲醛室温固定15min。Triton X-100处理，血清封闭后分别滴加Oct3/4，Sox2，P63，β-catenin-抗，4℃孵育过夜。避光加入TRITC标记的荧光二抗，DAPI复染细胞核后，倒置荧光显微镜BX51(Olympus，Tokyo，Japan)观察结果。　　 4、Western印迹实验　　 收集5-FU作用前后的HBE细胞，按蛋白抽提试剂盒说明抽提细胞总蛋白，加入1×SDS样品缓冲液，100℃煮沸5min，离心后上样。12%SDS-PAGE电泳分离，恒压湿转膜120mins，含5%脱脂奶粉的TTBS室温封闭2hrs，一抗分别用Oct3/4、Sox2、P63、β-catenin和β-actin，4℃孵育过夜。HRP偶联的山羊抗兔IgG或兔抗山羊IgG或山羊抗小鼠IgG作为二抗，室温孵育2hrs，洗膜后，ECL化学发光法显影成像。相同条件下用β-actin作为内对照。　　 5、集落形成实验　　 消化细胞成单细胞悬液，将细胞做梯度倍数稀释，按每皿50、100、200个细胞的密度分别接种于含10 ml37℃预温的培养液中。在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养14天。14天后，终止培养，加入纯甲醇5 ml，固定15 min。去固定液，加Giemsa应用染色液染30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。计算克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%　　 6、无血清+生长因子悬浮培养富集干细胞　　 HBE细胞用5-FU(40μg/ml)处理48h后，弃去加药培养液，消化成单细胞悬液。按1×104个/ml接种于含EGF20ng/ml、bFGF20ng/ml和胰岛素4μg/ml的DMEM/F12无血清培养液中悬浮培养。每2天加1次生长因子，1周换液2次，培养2周。每天观察经5-FU处理前后的HBE细胞在无血清培养液中形成干细胞球的过程。　　 7、裸鼠移植实验　　 选择5周龄的雄性裸鼠，5-FU处理前后细胞按5×105个/200μl PBS，进行接种。每周观察2次，移植4周后给裸鼠施行安乐死。称量肿瘤大小，重量，拍照。肿瘤切取后常规4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作病理切片，HE染色，免疫组织化学染色。　　 8、HE染色　　 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片。二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，苏木素染核，盐酸酒精分化。自来水冲洗返蓝20min，伊红染色。梯度酒精脱水，透明，中性树胶封片。　　 9、组织切片免疫组化　　 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片。经脱蜡，脱苯，水化后，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)检测组织中Oct3/4、P63、Alpha fetoprotein、classⅢβtubulin、肌动蛋白actin的蛋白表达情况。　　 10、免疫荧光双染　　 将细胞接种于24孔板中培养生长。贴壁后按40μg/ml的浓度加入5-FU，24 h后测免疫荧光。4%多聚甲醛室温固定15min。Triton X-100处理，小牛血清封闭后分别滴加Oct3/4-抗工作液，4℃孵育过夜。避光加入TRITC标记的荧光二抗，马血清封闭后分别滴加二标一抗(H3K4Me2，H3K9Ace，H3K9Me3，H3K27Me3，HP1-α，PML)，37℃孵育2.5h。避光加入FITC标记的二标荧光二抗，37℃孵育1h。DAPI复染细胞核后，倒置荧光显微镜BX51(Olympus，Tokyo，Japan)观察结果。　　 11、透射电镜观察　　 取1mm×1mm×1mm大小组织，2.5%戊二醛固定24h，梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切厚度为50～70nm的切片，甲苯胺蓝染色，电镜观察、拍片、记录。　　 12、统计学处理　　 数据至少经过3次实验获得，采用SPSS11.5统计学软件进行分析，以P<0.05为有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、5-FU对HBE细胞增殖的影响　　 利用MTT的方法来分析5-FU对HBE细胞增殖的影响。不同浓度的5-FU作用于HBE细胞后，细胞生长有不同程度的抑制，这种抑制呈时间剂量依赖性。我们选用5-FU40μg/ml作用24h来进行后续的实验。　　 二、5-FU作用后流式细胞仪分析SP细胞比例增多　　 加入PI染料排出死细胞和细胞碎片后，对5-FU作用前后的HBE细胞进行了SP细胞分选。P3门显示的SP细胞，能排出Hoechst33342染料。在正常的HBE细胞中，SP细胞占0.5%；当同时加入verapamil孵育30分钟后，SP细胞的比例下降到0.2%。经5-FU处理后，SP细胞增加为0.8%，当同时加入verapamil孵育30分钟后，SP细胞的比例下降到0.2%。经5-FU处理后，SP细胞的比例明显增加。　　 三、细胞免疫荧光　　 1、5-FU作用后出现胚胎干细胞的标记物阳性表达　　 为了检测胚胎干细胞的标记物，对5-FU处理前后的细胞进行了Oct3/4和Sox2的免疫荧光染色分析。Oct3/4和Sox2阳性表达为核呈现明亮红色染色。在正常的HBE细胞中，Oct3/4为几乎为阴性表达；在5-FU作用后，出现了Oct3/4的阳性表达。Sox2的表达与Oct3/4是一致的。　　 2、5-FU作用后出现分化的标记物P63的低表达　　 众所周知，HBE细胞表达分化的标记物P63。在正常的HBE细胞中，有P63的高阳性表达；在5-FU作用后，P63的表达明显降低，证实在5-FU作用后，出现了未分化的状态。　　 3、β-catenin的表达　　 Wnt信号通路在控制干细胞的自我更新方面起着重要作用，β-catenin是Wnt信号通路的一个关键因子。未经5-FU作用的HBE细胞，β-catenin主要为胞膜和胞浆表达；在5-FU作用后，β-catenin出现表达增加并表现为核表达。　　 四、Western blot分析　　 在正常的HBE细胞中，Oct3/4，Sox2，β-catenin为低表达；而经5-FU处理后，表达水平升高。P63在正常的HBE细胞中高表达，经5-FU处理后表达水平下降。　　 五、5-FU作用后，克隆形成能力增强　　 对5-FU作用前后的HBE细胞按材料和方法所述进行了克隆形成能力的检测。原始的HBE细胞的克隆形成率为7%。而经5-FU处理后的细胞克隆形成率增加了2.5倍，达到了18%。并且形成的克隆体积更大，Giemsa染色更深。　　 六、5-FU作用后，干细胞球形成能力增强　　 HBE经5-FU作用48h后，大部分细胞死亡，仅有一少部分细胞保存了下来。存活下来的细胞用胰酶消化后加无血清培养液和生长因子悬浮培养，观察了干细胞球的形成能力。经5-FU作用前后的HBE细胞按10000个/ml的密度接种。培养2周后从单细胞悬液形成的悬浮干细胞球可以看出未处理的分化的HBE细胞表现为低干细胞球形成能力，而5-FU作用后出现高的干细胞球形成能力，同时该细胞球与HBE细胞球相比，球体较大，折光性强，细胞间连接更紧密，难以区分细胞间界限。这些都说明了存活下来的细胞有较高的自我更新能力。七、5-FU作用后，富集干细胞群体获得畸胎瘤形成能力　　 为了比较5-FU作用前后HBE细胞是否有多分化能力，我们按5×105个细胞进行裸鼠移植。在移植后4周，裸鼠被处死，对肿瘤进行称重，拍照，HE染色。HBE细胞移植组没有肿瘤形成，经5-FU作用后的细胞移植组都观察到肿瘤形成。经HE染色及免疫组化染色证实该肿瘤为畸胎瘤。HE染色可见多层鳞片状上皮细胞(外胚层)、平滑肌(中胚层)、腺上皮(内胚层)组织。免疫组织化学染色结果可见classⅢβtubulin阳性表达为神经样细胞，SM阳性表达为平滑肌样细胞。其中畸胎瘤有三个胚层分化。畸胎瘤的形成证实了其多能性。而干细胞巢呈现Oct3/4染色阳性，说明为富含干细胞的未分化组织。透射电镜观察该细胞核较大，核内常染色质多，均匀分布；异染色质很少，未凝集成块。细胞浆少，细胞间连接少见。提示该细胞为未分化的幼稚细胞。八、Oct3/4阳性细胞与阴性细胞组蛋白修饰、染色质状态比较　　 基因组的表达分析说明了干细胞的分化很可能与异染色质的增多有关。为了了解在5-FU作用前后染色质状态的变化，我们先用Western blot的方法分析了特异性的组蛋白修饰的抗体。最近的研究说明H3K4Me2和H3K9Ace是转录后活性的标记物；而H3K9Me3和H3K27Me3是转录后抑制性标记物。　　 接下来，我们用相应的特异性抗体与Oct3/4做了免疫荧光双染。在Oct3/4(+)的细胞中，H3K4Me2和H3K9Ace的表达也为阳性。在Oct3/4(-)的细胞中，H3K4Me2和H3K9Ace的表达也丧失。H3K9Me3和H3K27Me3是在Oct3/4(-)的细胞中出现，在Oct3/4(+)的细胞中丧失。在Oct3/4与组蛋白修饰之间的特异性联系说明组蛋白修饰与Oct3/4基因的染色质形成有关。　　 PML小体是参与核转录的因子，并与某些基因富集的常染色质区域相联系。为了检测HP1-α与PML在这个过程中是如何表达的，做了Western blot和免疫荧光双染分析。Western blot的结果显示HP1-α与PML蛋白在正常的HBE细胞中低表达，而在5-FU作用后的细胞中高表达。免疫荧光双染显示HP1-α在Oct3/4(+)的细胞中出现，而在Oct3/4(-)的细胞中消失。PML小体与组蛋白的乙酰化转移酶相关，在5-FU作用后Oct3/4(+)细胞中数量较多，可达到15～20个；而在正常的Oct3/4(-)的细胞中，PML小体的数量较少，仅有3～5个。PML小体与Oct3/4细胞的特异性联系说明PML小体也与Oct3/4基因的染色质形成有关。　　 结论：　　 1、经5-FU处理后，支气管上皮细胞中SP细胞增加，出现胚胎干细胞的阳性表达，克隆形成率提高，裸鼠移植后畸胎瘤形成率增高。本研究证明5-FU处理后能富集支气管上皮细胞株中干细胞群体。　　 2、表观遗传修饰支持Oct3/4可为气管干细胞标记物。　　 3、5-FU作用支气管上皮细胞后，组蛋白修饰及染色质重塑调控内源性Oct3/4转录激活，从而富集气管干细胞。　　 4、经5-FU处理从体细胞中富集干细胞，将为今后的气管干细胞移植、器官修复奠定实验和理论基础。