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本文以促进蛋白多肽类药物胰岛素口服吸收为主体思路设计了一种基于巯基化偶联物的新型生物粘附纳米给药系统。对载药纳米粒子的各项理化性质进行了较为全面的研究,评价了其在糖尿病大鼠和正常大鼠中的降血糖作用,对纳米粒子促进胰岛素吸收的机制进行了较为深入的探讨。首先以常用的肠溶型包衣材料Eudragit L100和L-半胱氨酸盐酸盐为原料通过EDC和NHS介导合成Eul-cys偶联物。通过核磁共振(HNMR)、红外光谱(FT-IR)等手段证明偶联物的生成。通过Ellman’s试剂反应测定偶联物的巯基含量最高约为390.3±13.4μmol/g。其在水、甲醇、乙醇、氯仿等常用溶剂中的溶解度均不好,仅在DMSO中极微溶解。偶联物自由巯基在pH 5.0以下稳定,pH升高稳定性下降。偶联物的溶胀度随着pH值升高而增加,且与巯基含量成正比,随着离子强度升高而降低。流变学实验研究偶联物产生较高生物粘附性的机制,即与粘液糖蛋白相互作用形成二硫键而实现与粘液层的紧密结合。确立了胰岛素的HPLC含量测定方法以满足药物体外分析要求及释放测定。考察pH值对偶联物粒子溶胀的影响,发现在较高pH条件下粒子溶胀明显,溶胀度随着pH降低而降低。利用Eul-cys偶联物pH敏感的溶胀-收缩特征,通过调节其水溶液至较高pH值后加入胰岛素酸性溶液的方法实现药物装载,然后降低体系的pH值到胰岛素的等电点以下,使药物与载体带相反电荷,通过静电作用形成负载胰岛素的纳米粒,同法制备载胰岛素的Eul纳米粒。Eul-cys和Eul纳米粒的粒径分别为324.2±39.0 nm和308.8±35.7 nm,ζ电位分别为-3.1±0.8和-2.9±0.8mv, Eul-cys纳米粒子巯基含量为183.4±13.5μmol/g。选择2%海藻糖为冻干保护剂将纳米粒冻干,冻干后样品外观良好,复溶后粒径变化不大。药物在两种纳米粒中的释放呈现明显的pH依赖特征,药物在酸性条件下释放缓慢而在中性条件下快速释放。圆二色谱和小鼠降血糖实验均证明包载于纳米载体中药物的空间构象及生理活性没有发生明显改变。大鼠离体肠段生物粘附性实验表明与Eul纳米粒相比,Eul-cys纳米粒在各肠段均表现出更强的生物粘附性,尤其在空肠和回肠段更佳。将两种纳米粒口服给予糖尿病大鼠,Eul-cys纳米粒显示出比Eul纳米粒更好的降血糖效果,12小时相对皮下注射组的药理生物利用度分别为7.33+0.33%和2.65+0.65%。组织学研究显示聚合物纳米粒对肠粘膜没有毒性,是一种安全的载体。在Eul-cys纳米粒的基础上加入还原型谷胱甘肽(GSH),以进一步提高胰岛素的粘膜吸收。考察GSH加入量对纳米粒生物粘附性的影响,载体与GSH质量比大于等于4：1时,纳米粒的生物粘附能力没有出现显著降低。新制备的Eul-cys/GSH纳米粒子的粒径在260.0±17.1 nm,ζ电位-3.1±0.9 mv,自由巯基含量为413.7 ± 17.2 μmol/g,包封率与载药量分别为90.4±1.0%和17.8±0.7%。冻干后粒径增加不明显,包封率和载药量没有明显下降。装载GSH后,胰岛素的释放减慢,是两者从纳米粒表面孔道竞争性释放的结果。在体药物释放结果表明,使用Eul-cys和Eul-cys/GSH两种纳米粒子有接近50%的药物存在于粘液层,而溶液组则有约70%的药物存在于肠腔。大鼠小肠离体转运结果表明,与溶液组相比,纳米粒组在各肠段均能更好地促进胰岛素的吸收,吸收存在部位差异,在空肠和回肠段较高,而十二指肠和结肠处较低。正常大鼠回肠闭合肠袢给予载药Eul-cys和Eul-cys/GSH纳米粒,发现两者均有降血糖作用,15分钟血糖开始降低,2小时达到最低,分别约为初始值的60%和49%。联用GSH后Eul-cys的降血糖能力增强,说明GSH能够促进胰岛素的粘膜转运。采用X射线衍射(XRD)及X射线光电子能谱(XPS)研究药物在纳米粒中的存在状态,以DSC及FT-IR考察药物与载体间的相互作用。结果表明,药物被装载到纳米粒中以后,可能处于一种高度分散的无定形状态,药物通过静电与载体相互作用,这种结合仅是物理作用,非化学结合。研究了Eul-cys纳米粒对胰岛素吸收促进作用的机理,包括钙离子结合,蛋白酶抑制以及降低细胞跨膜电阻(TEER)值等。Eul-cys偶联物能够结合钙离子,进而影响钙离子依赖的消化酶的活性,减少药物的降解。采用两种细胞模型Caco-2单层细胞和Caco-2/HT29-MTX共育细胞评价载体的安全性、胰岛素的跨细胞转运及转运机制。以癸酸钠(SC)为对照,研究GSH对胰岛素的吸收促进效果。MTT和LDH实验结果显示Eul-cys和Eul-cys/GSH细胞毒性较小。TEER值测定结果表明,Eul-cys联用GSH和SC均能引起TEER值的降低,SC作用强于GSH, GSH组TEER值的回升无浓度依赖,而SC组TEER值恢复有浓度依赖,说明GSH对细胞紧密连接的影响是短暂可逆的,其安全性高于SC。纳米粒联用两种吸收促进剂促进胰岛素跨细胞转运,结果显示,与溶液组相比,Eul-cys纳米粒联合低中高浓度的SC对药物在Caco-2细胞中的通透作用分别提高了2.6、4.0和8.1倍,在Caco-2/HT29-MTX共育细胞中分别提高了4.0、5.5和9.6倍；而Eul-cys联合低中高浓度的GSH对药物在单层细胞中的通透作用分别提高了1.8、2.3和3.0倍,而在共育细胞中分别提高了1.7、2.3和3.2倍。将共育细胞的粘液层除去,发现GSH组的Papp值与原来相比提高2.4倍,而SC组影响不明显,说明粘液层可能影响GSH介导的吸收促进作用及巯基功能药物传递系统的促吸收效果。Eul-cys联合GSH和SC对Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1并没有产生明显影响,但从细胞TEER值结果可知GSH可以打开紧密连接,主要是通过抑制酪氨酸磷酸(PTP)酶来实现的,说明巯基纳米粒对胰岛素的吸收促进作用主要是增加其细胞旁路的吸收。