现代医学研究表明,肿瘤的发生与细胞周期调控的失控有关。在众多的与肿瘤相关的基因研究中,一个重要的基因是P53基因,它在维持细胞生长、抑制细胞恶性增殖中起着重要的作用。研究报告显示,P53基因在半数以上的肿瘤中是失活的,失活的原因包括：基因突变和P53蛋白异常降解。P53基因的突变导致转录因子P53蛋白构象发生变化,导致其不能与正确的靶基因结合,如P21基因；P53蛋白的降解是由MDM2 (Mouse Double Minute-2)蛋白所引起的泛素化降解,不足以发挥其功能,导致细胞增殖异常。增加P53蛋白的活性是肿瘤治疗的一个最重要的靶点。目前增加P53蛋白的活性策略主要有：(1)通过基因转染的方法,将野生型的P53基因导入肿瘤细胞,使之在肿瘤细胞中过表达；或者应用RNAi等技术使P53基因的拮抗蛋白表达减少,恢复P53蛋白的表达。(2)重新激活野生型P53蛋白。这种策略主要是应用小分子药物阻止P53蛋白与MDM2之间的相互作用。(3)激活突变型P53蛋白,主要使用一些小分子药物使突变型P53蛋白恢复正常构象并转变为具有野生型P53的功能。目前转基因治疗的方法有其固有缺点如：免疫原性、靶向性、安全性等问题。相比较而言,激活野生型或突变型P53蛋白的方法在这方面有良好的前景,目前已经筛选到了一些小的分子化合物,在应用过程有着良好的效果,一些药物进入临床Ⅰ期或Ⅱ期。但这种激活的方法需要一个很大的化合物文库,其工作非常复杂,是导致发现与P53相互作用的小分子化合物的前体很少的原因之一。因此构建一个好的化合物文库和建立一种好的筛选方法,是解决目前该项研究的瓶颈问题。现代的医学研究证明中草药具有抗肿瘤的功效,其活性成分呈现复杂性和多样性,且大多数活性成分都是一些极性较强的物质如黄酮类、生物碱类、皂甙类、木脂素类、萜类、酸类、醇类、蒽醌类、酚类和糖类等。因此,中草药可以说是一个巨大的化合物文库。既然中医药是一个巨大的化合物文库,利用高通量筛选技术(HST)来筛选抗肿瘤活性成分将是值得探索的方向。HST技术包括建立以药物作用靶点为主要对象的分子和细胞水平的筛选模型,作为细胞水平一项快速灵敏的筛选技术,双荧光素酶报告基因技术一般常用于药物的筛选及启动子的研究。目前双荧光素酶检测系统基本上是采用Promega公司的双质粒瞬时共转染到细胞中,这种双质粒转染,由于转染效率的差别,结果较难重复。此外瞬时转染的方法一方面由于不能用于建立细胞株,每次筛选都要重新转染；另一方面对一些难转染的细胞,会导致转染效率的低下等缺点。与常规的转染方法相比,慢病毒具有感染效率高、感染宿主范围广、表达稳定、持久的优点。本课题基于当前对肿瘤发病机制深入研究及高通量筛选技术的基础上,拟构建带P21启动子的双荧光素酶慢病毒载体,EGFP用于监测转染效率,包装慢病毒用于感染细胞并建立细胞株,建立一种直接、高效的细胞筛选系统,能用于激活P53蛋白的药物筛选实验。本研究的主要研究内容和结果如下：第一部分：PLL3.7-Dluc载体的构建与鉴定首先利用引物设计软件primer5.0设计三对引物,从健康人血液中提取人类基因组进行PCR扩增P21启动子,连接到pGL3-baisic载体中后再酶切得到P21-Fluc片段,P21-Flue片段与双酶切的pLL3.7慢病毒载体连接得到pLL3.7-Fluc载体。然后设计引物从pRL-SV40载体扩增Rluc基因片段,连接到pIRES2-EGFP载体上,利用引物从重组载体pIRES2-EGFP-Rluc扩增获得Rluc-IRES-EGFP片段与pLL3.7-Flue载体连接,得到pLL3.7-Dluc。重组质粒pLL3.7-Dluc转染293FT细胞后观察EGFP表达及进行双荧光素酶检测。实验结果表明,成功地从人基因组克隆出P21启动子,并通过一系列分子克隆技术成功地构建了含EGFP监测、双荧光素酶检测的pLL3.7-Dluc载体。转染293FT细胞后,成功观察到EGFP的表达,检测Firefly Luciferase、Renilla Luciferase的荧光值达到106,表明成功地构建了可用于药物筛选的重组载体pLL3.7-Dluc。第二部分：包装慢病毒,建立细胞株。将成功构建的pLL3.7-Dluc表达载体与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.91、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G共转染至293FT细胞中,培养48h后收集含病毒颗粒的上清,离心后过滤获得病毒上清,293FT测定病毒滴度,感染目标细胞。实验结果表明转染24小时可以看到绿色荧光蛋白的表达,且转染效率达到80%以上。但病毒滴度测定结果表明,没有成功包装病毒或者是包装的病毒滴度太低而无法感染293FT细胞及Eca109、U251细胞。第三部分：细胞毒性试验及筛选激活P53的中药组份实验U251、Eca109细胞通过MTT抑制试验得到48小时的半数致死剂量。U251、Eca109细胞瞬时转染pLL3.7-Dluc质粒,无药物处理作阴性对照,空转组为空白对照组。半致死剂量药物处理细胞模型48h后作双荧光素酶检测。实验结果表明通过MTT实验获得药物的半致死剂量浓度,药物处理细胞后作双荧光素酶检测数据经SPSS13.0统计后表明,中药姜黄素、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rb1有助于增强P53蛋白的活性。通过上述实验的初步研究,得到如下结论：经过测序、EGFP表达及转染293FT作双荧光素酶检测,表明成功地构建慢病毒载体pLL3.7-Dluc载体用于药物的筛选。但是病毒滴度测定表明没有成功包装病毒或者是病毒滴度太低,因此无法建立稳定筛选的细胞株。药物筛选的结果表明：姜黄素、丹参酮ⅡA、人参皂苷Rb1有助于增强P53蛋白的活性。