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力达霉素(lidamycin,LDM),原名C-1027,是一种新型的烯二炔类抗肿瘤抗生素,由球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)产生。其抗肿瘤活性比临床常用的阿霉素强10,000倍,已经进入临床Ⅱ期试验。力达霉素由一个酸性辅基蛋白CagA(C-1027 apoprotein、C-1027AG,也写作LDP)和一个烯二炔结构的发色团(chromophore,也写作LDC)非共价结合组成,发色团为活性组分,辅基蛋白保护和运载发色团。由于力达霉素自身具有辅基蛋白,可以将其与抗肿瘤抗体偶联成为融合蛋白,改造为靶向特异肿瘤的载体,构建导向性力达霉素。Ⅳ型胶原酶降解细胞基底膜中的Ⅳ型胶原,破坏基底膜及细胞外基质的完整性,引起肿瘤细胞的侵袭与转移,Ⅳ型胶原酶已经成为抗肿瘤研究的靶标。抗Ⅳ型胶原酶抗体可以抑制Ⅳ型胶原酶的活性并可作为导向药物的载体。本工作根据已知的抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因序列,设计合成了具有链霉菌偏好密码子的抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V_H(抗Ⅳ型胶原酶抗体重链可变区)基因,构建了含有辅基蛋白与抗Ⅳ型胶原酶单域抗体融合蛋白基因cagA-V_H和用于筛选的阿普霉素抗性基因aac(3)Ⅳ的重组质粒pBSH,用接合转移的方法导入力达霉素产生菌S.globisporus C-1027,通过同源重组双交换,以cagA-V_H -aac(3)Ⅳ取代力达霉素生物合成基因簇中原有的辅基蛋白基因cagA,得到基因工程菌株S.globisporus C-1027 V_H,以获得Ⅳ型胶原酶靶向的力达霉素。对基因工程菌株进行发酵,以枯草杆菌(Bacillus subtilis)为检定菌,结果表明基因工程菌株发酵液具有一定的抑菌活性,但与原产生菌相比活性较低。经Western blot分析在胞内能检测到融合蛋白和降解的辅基蛋白,而胞外仅检测到降解的辅基蛋白条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。同时构建了含有融合蛋白基因cagA-V_H但不含抗性基因的重组质粒pBS03H,通过同源重组双交换,以cagA-V_H基因取代cagA基因,得到仅融合了抗Ⅳ型胶原酶单域抗体基因的基因工程菌株S.globisporus C-1027NV_H。同样进行了发酵、抑菌活性、SDS-PAGE和Western blot的检测,结果与S.globisporus C-1027 V_H基本相同。为了增加融合蛋白的表达量,获得高活性的导向性力达霉素,本工作进一步构建了辅基蛋白阻断株,并通过导入多拷贝的融合蛋白表达质粒的策略来提高融合蛋白的表达量。构建重组质粒pBSA,将质粒接合转移至S.globisporus C-1027中,采用同源重组双交换的方法将cagA基因阻断。通过抗性筛选、PCR和Southern blot验证,最终获得辅基蛋白阻断株,命名为S.globisporus AKO。用四种辅基蛋白表达质粒pKCTA900、pSETTA900、pLTA900和pLTA400分别导入在自身启动子和/或强启动子控制下的cagA基因对阻断突变株S.globisporus AKO进行互补,得到相应的互补菌株。对阻断株和互补菌株进行发酵,发酵液的抑菌活性和HPLC分析结果表明阻断株完全丧失了力达霉素的产生能力,而互补菌株能不同程度地恢复产生力达霉素,其中S.globisporus AKO/pKCTA900基本恢复到野生株的水平。将质粒pKCA900、pSETA900、pLA900和pLA400接合转移至野生株S.globisporusC-1027中构建了相应的辅基蛋白过表达菌株。抑菌活性和HPLC分析结果表明过量表达cagA基因可以提高力达霉素的产量。构建辅基蛋白-单域抗体的融合蛋白表达质粒pKCTH2600、pSETTH2600分别导入辅基蛋白阻断株中进行表达。重组菌株S.globisporus AKO/pKCTH2600发酵液的抑菌活性在发酵晚期与野生株相当,经Western blot分析在胞内、胞外均能检测到融合蛋白的特异条带。ELISA检测到融合蛋白的免疫活性。结果表明融合蛋白在辅基蛋白阻断株中以多拷贝质粒的形式获得表达且表达量较基因工程菌株S.globisporus C-1027 V_H和S.globisporus C-1027 NV_H明显提高。综上所述,本工作通过优化融合基因的表达策略,提高了融合蛋白的表达水平,为获得抗Ⅳ型胶原酶单域抗体V_H导向的力达霉素奠定了基础,为进一步构建高表达的导向力达霉素重组菌株提供了新的技术平台。