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第一部分:整合素αvβ3/αvβ5受体拮抗治疗失分化甲状腺癌的实验研究 目的:乳头状甲状腺癌(Papillary Thyroid Cancer,PTC)患者常常预后较好,但是其疾病复发及转移并不少见。部分PTC患者因其病灶摄取放射性碘(Radioactive Iodine,RAI)的能力差或者完全不能摄取放射性碘,不宜进行RAI治疗,预后相对较差。寻找有效的靶点对这部分患者进行治疗显得非常有必要。整合素在肿瘤的多种生物学行为中均发挥着重要的作用,本研究中我们检测了整合素α vβ3及α vβ5受体在PTC细胞株中的表达,并分析了整合素阻断治疗对PTC细胞及动物模型的抗肿瘤效果。 方法:首先我们通过荧光激活细胞分选术检测了西伦吉肽的作用靶点,整合素αvβ3及α vβ5在三种PTC细胞株(BCPAP、K1及TPC1)中的表达情况,并用荧光染色的方法进一步直观的验证了整合素α vβ3及α vβ5在PTC细胞株中的表达。随后,我们通过细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)及流式细胞分选术对药物作用下细胞的增殖及凋亡进行了评估;并通过Transwell的方法分析了整合素阻断对细胞的迁移及侵袭能力的影响。通过给裸鼠皮下注射K1细胞我们建立了小鼠甲状腺癌异位种植模型。在小鼠给药期间,我们通过测量肿瘤的长短径大小监测肿瘤的生长,并通过免疫组化染色肿瘤切片的方法评估了肿瘤出血坏死情况、微血管密度变化及肿瘤细胞凋亡的程度。 结果:我们观察到三种PTC细胞均存在整合素α vβ3及α vβ5的表达,TPC1细胞中整合素α vβ3及α vβ5的表达最高(分别为69.3±7.4%及52.8±1.8%)(P<0.05),而在BCPAP及K1细胞中,整合素α vβ3及α vβ5的表达水平中等(BCPAP:35.1±2.3%及41.9±3.2%,K1:37.7±2.3%及48.0±1.4%)(P≤0.05))。通过西伦吉肽阻断整合素α vβ3及α vβ5的受体活性后,三种细胞均从培养瓶底部脱离,细胞的增殖速率也均受到明显抑制。与BCPAP及K1细胞相比,药物作用后TPC1细胞增殖受抑制最为明显,其细胞凋亡率达到37.8%(BCPAP及K1细胞分别为6.67%和9.43%)。Transwell实验结果显示整合素α vβ3及α vβ5受体活性被阻断后,三种PTC细胞的迁移及侵袭能力均受到显著抑制(P≤0.05)。动物实验中,50mg/kg/天的剂量持续作用10天未发现小鼠肿瘤生长受到抑制,然而肿瘤的免疫组化染色结果显示与对照组小鼠肿瘤相比,药物组小鼠肿瘤出血坏死明显,微血管密度明显降低,肿瘤细胞凋亡增多(P≤0.05)。 结论:本研究证实了PTC细胞株上存在整合素α vβ3及α vβ5的表达。通过西伦吉肽阻断整合素α vβ3及α vβ5受体活性后,细胞凋亡增加,细胞的增殖、迁移及侵袭能力均受到显著抑制。体内实验则显示西伦吉肽可抑制肿瘤的新生血管生成并促进肿瘤细胞凋亡,但是该抑制效应尚未表现为肿瘤体积的缩小。 实验中,50mg/kg/天的剂量持续作用10天未发现小鼠肿瘤生长受到抑制,然而肿瘤的免疫组化染色结果显示与对照组小鼠肿瘤相比,药物组小鼠肿瘤出血坏死明显,微血管密度明显降低,肿瘤细胞凋亡增多(P≤0.05)。 结论:本研究证实了PTC细胞株上存在整合素α vβ3及α vβ5的表达。通过西伦吉肽阻断整合素α vβ3及α vβ5受体活性后,细胞凋亡增加,细胞的增殖、迁移及侵袭能力均受到显著抑制。体内实验则显示西伦吉肽可抑制肿瘤的新生血管生成并促进肿瘤细胞凋亡,但是该抑制效应尚未表现为肿瘤体积的缩小。 第二部分:18F-AIF-NOTA-PRGD2显像在分化型甲状腺癌淋巴结转移灶中的应用价值 目的:整合素α vβ3显像已被广泛应用于临床及临床前期研究中,但是尚未有研究报道其与18F-FDG相比在诊断肿瘤、监测治疗疗效方面的价值。在本研究中,我们将一种新的整合素α vβ3显像剂18F-AIF-NOTA-PRGD2应用于存在淋巴结转移的甲状腺癌患者,分析其与18F-FDG相比在诊断病灶、评估病灶整合素表达方面的价值。 方法:20位存在可疑淋巴结转移的分化型甲状腺癌患者(Differentiated Thyroid Cancer,DTC)被纳入该研究,分别进行18F-AIF-NOTA-PRGD2 PET/CT显像及18F-FDG PET/CT显像。16位受检者进行了超声引导下颈部淋巴结细针穿刺术(Fine Needle Aspiration Biopsy,FNAB),病灶的病理结果作为判断病灶良恶性的金标准;4位受检者不同意接受FNAB,其病灶的良恶性根据其临床随访结果及其他临床检查如颈部超声、血清TG、TG抗体浓度进行判断。 结果:20位受检者经影像学检查(颈部超声、CT等)共发现39个可疑淋巴结转移灶,经病理结果及临床随访证实其中35个病灶为恶性淋巴结转移灶。放射性碘难治性(Radioactive Iodine Refractory,RAIR)病灶与良性病灶的18F-AIF-NOTA-PRGD2 SUV值分别为2.5±0.9和2.8±0.9,而18F-FDG SUV值分别为4.5±1.6和3.3±1.2。恶性病灶对18F-FDG的摄取显著高于其对18F-AIF-NOTA-PRGD2的摄取(P<0.05)。病灶对两种显像剂的摄取未发现相关性(r=0.114,P=0.515)。此外,15个直径大于1.5cm的病灶对18F-AIF-NOTA-PRGD2的摄取高于直径小于1.5cm的病灶对显像剂的摄取。 结论:尽管DTC患者的淋巴结转移灶对显像剂18F-AIF-NOTA-PRGD2的摄取显著高于周围正常组织,它在诊断病灶方面的价值劣于18F-FDG。病灶对18F-AIF-NOTA-PRGD2和18F-FDG的摄取不存在相关性,这意味着18F-FDG在诊断RAIR DTC病灶方面存在优势,而18F-AIF-NOTA-PRGD2在评估病灶整合素表达及监测抗血管治疗疗效方面存在价值。 第三部分:BRAF抑制剂联合HDAC抑制剂对甲状腺癌细胞株摄碘基因表达及摄碘能力的影响 目的:使用BRAFV600E抑制剂恢复碘难治性(Radioactive Iodine Refractory,RAIR)甲状腺癌摄碘基因的表达及对放射性碘的摄取能力使其重新能够摄取 RAI已经成为一种新的治疗 RAIR甲癌的策略,然而近期的临床研究表示单独使用BRAFV600E抑制剂恢复RAIR甲癌摄碘基因表达及摄碘能力的效果有限。考虑到NIS启动子区去乙酰化酶(Histone Deacetylase,HDAC)促进组蛋白去乙酰化是BRAFV600E沉默 NIS基因表达的机制之一,我们认为同时抑制 BRAFV600E及HDAC或许能更有效的促进RAIR甲癌摄碘基因的表达及摄碘能力的增加。 方法:我们将两种已被批准用于临床肿瘤治疗的药物 PLX4032(维罗非尼)和HDAC抑制剂(伏立诺他)用于甲状腺癌细胞株,利用实时荧光定量PCR检测其摄碘基因的mRNA表达情况、免疫荧光染色法定位钠碘转运体(Sodium Iodine Symporter,NIS)的表达情况及摄碘功能试验评估其对RAI的摄取能力。 结果:我们发现 PLX4032单独作用于甲状腺细胞株时可选择性得促进含有BRAFV600E突变的细胞株摄碘基因的表达及摄碘功能的增加。SAHA作为HDAC抑制剂可使所有细胞株的摄碘相关基因的表达均增加并相应得改善细胞株的摄碘能力。在含有BRAFV600E突变的细胞株中,PLX4032联合SAHA可协同促进摄碘基因的表达及摄碘功能的增加,TSH刺激则能进一步放大这种协同作用。在 BRAF野生型细胞株内,PLX4032不能诱导摄碘基因的表达及摄碘能力的增加,其与SAHA在促进基因表达及细胞摄碘能力方面不存在协同作用。 结论:同时抑制 BRAFV600E与 HDAC可有效促进含有 BRAFV600E突变的甲状腺癌细胞株摄碘相关基因的表达并促进细胞摄碘能力的增加;TSH刺激则能进一步促进PLX4032与SAHA的协同效应。