论文部分内容阅读
脂肪组织是乳腺（Mammary gland,MG）的重要组成部分,脂肪细胞可以分泌关键的“脂肪因子”影响上皮细胞发育和乳腺功能,对泌乳的正常进行和乳腺的健康发育具有重要的生理意义。在生理和组织来源层面上,奶畜乳腺功能与人体更为相似,为研究乳腺组织发育和乳腺疾病提供理想模型。奶畜乳腺组织具有特殊的再生性退化现象,即妊娠末期和干奶期的叠加。乳腺周期性重构的实质是乳腺组织退化和再生的过程。乳腺组织在退化的同时,细胞快速变化,期间腺泡结构保持完整但数量减少,此过程通常在2个月内完成。在乳腺重构过程中,脂肪细胞随之发生变化,但其变化规律及在乳腺重构的作用机制尚待深究。本研究以奶山羊为研究模型,通过组织形态等研究表征乳腺组织在乳腺重构中的变化规律;通过转录组测序和体外细胞试验,揭示脂肪组织在乳腺重构中动态变化的生物学规律,将对解析乳腺发育的生物学内涵、保障乳腺健康具有重要意义。（1）乳腺重构中乳腺组织的变化规律表征选取奶山羊3头,在乳腺重构期的5个时间点（产前8周,产前4周,产前1周,产后1周和产后4周）进行活体采样,获得奶山羊乳腺样本;通过HE（Hematoxylin-Eosin）染色、免疫荧光、透射电镜（Transmission electron microscopy,TEM）、脂滴染色等试验对乳腺腺泡及周围脂肪细胞进行表征。HE染色发现在乳腺重构过程中,腺泡先萎缩塌陷,腺泡横截面积在产前4周（4 weeks before parturition,4WBP）缩至最小,4WBP后逐渐增大。免疫荧光检测发现,4WBP乳腺脂肪细胞数量显著增多;4WBP后,脂肪细胞比例逐渐减少。透射电镜结果显示腺泡间存在一定数量具有脂肪细胞特征的细胞类型,但脂滴含量较少,其他细胞器结构较为旺盛。脂滴染色发现腺泡间细胞几乎未着色,而构成腺泡的乳腺上皮细胞则出现大量荧光染色,这些绿色荧光为乳汁中的乳脂成分。这些结果表明:在奶山羊乳腺重构过程中,腺泡先萎缩塌陷而后再生;脂肪细胞多处于不完全成熟的状态,细胞比例先增多后减少,在4WBP细胞比例达到最高。（2）乳腺脂肪细胞变化规律的机制研究根据配种时间和预产期,选择4头奶山羊,分别在4WBP和产后1周（1 week after parturition,1WAP）利用活体采样法采集乳腺组织,复合消化酶体系分离得到脂肪细胞后进行转录组测序,以探究奶山羊乳腺重构中调控脂肪细胞变化的生物学过程。数据分析表明,本研究在两个时间点均获得了高质量的转录组数据,在4WBP和1WAP两个时间点的乳腺脂肪细胞中共获得21280个基因。1WAP和4WBP两组之间差异表达显著的基因共计2008个,其中1095个基因显著上调表达,913个基因显著下调表达,基因筛选条件为|log2（Fold Change）|＞1,P＜0.05。对差异表达的基因进行GO功能分析,结果显示4WBP组上调表达的生物学功能中主要与转录表达、细胞增殖调控以及细胞分裂等相关。差异表达基因KEGG富集分析结果提示脂肪细胞中差异显著信号通路包括MAPK、细胞周期、PI3K-AKT、TNF等,提示4WBP乳腺脂肪细胞发生了广泛的自我状态更新,包括增殖、凋亡、分化等。4WBP脂肪细胞激活MAPK和PI3K-AKT信号通路（P＜0.01）,对脂肪细胞的增殖和分化等进行调控。（3）乳腺脂肪细胞变化对乳腺发育的影响基于人端粒酶的慢病毒体系,筛选得到山羊永生化前体脂肪细胞系;在该细胞系中添加SB203580和PD169316特异性抑制MAPK通路,添加MK2206特异性抑制PI3K-AKT通路,检测其对脂肪细胞分化的影响;收集脂肪细胞分化初期（D0）、分化中期（D10）和分化末期（D15）的培养基,用于山羊乳腺上皮细胞（Goat mammary epithelial cell,GMEC）的培养,通过划痕和细胞周期（PI染色）试验检测其对GMEC增殖状况的影响。结果显示永生化的山羊前体脂肪细胞系具有较好的成熟分化能力。脂肪细胞油红O染色结果分析显示:MAPK（P＜0.01）和PI3KAKT（P＜0.01）通路被抑制后,前体脂肪细胞的分化率显著降低。划痕试验结果表明,相较于对照组,48 h后D15培养基显著抑制GMEC的增殖,表现为划痕面积差异显著（P＜0.001）。利用流式细胞仪检测GMEC细胞周期,结果显示细胞在G1期比例较高,S期比例较低。提示脂肪细胞分化培养基培养后,GMEC在G1期阻滞,使得S期比例下降,最终导致GMEC的增殖受到一定程度的抑制。以上结果提示MAPK信号通路和PI3K-AKT信号通路对脂肪细胞的成熟分化具有显著的促进作用,成熟分化的脂肪细胞对GMEC的增殖具有一定程度的抑制作用。综上所述,乳腺重构中奶山羊乳腺脂肪细胞表现为先增多后减少的变化规律,4WBP是乳腺重构的关键时间点。脂肪细胞的变化规律受到MAPK和PI3K-AKT信号通路的调节。脂肪细胞在乳腺重构中的规律变化对上皮细胞的增殖具有显著影响,可参与调节乳腺重构的过程。本研究对乳腺脂肪细胞的变化规律进行表征,为解析乳腺重构的生物学机制提供了基础数据和参考依据。