能够同时获得样品的形貌信息和光谱信息的高光谱显微成像技术是探索微观世界的重要手段之一,其具有非接触、无损害、精度高、重复性好等众多优点,已被广泛应用于生物检测领域。不同的高光谱显微成像系统能够获得不同类型的光谱图像,如吸收光谱图像、荧光光谱图像、拉曼光谱图像等。然而,由于生物样品的多样性和复杂性使得不同样品之间的光谱响应有着巨大差异,例如有些样品因自发荧光很弱而无法进行荧光光谱成像,有些样品则因为太厚而无法进行透射光谱成像,系统的应用往往受限于样品。目前,没有任何一种光谱成像技术能适用于所有生物样品的检测。此外,由于生物个体差异的因素,使得来自不同个体的同种生物组织的光谱响应也有所不同,因此难以确定与该组织所对应的光谱特征峰或者特征分布,给光谱鉴别带来了不利影响。为了克服这些缺点,并进一步促进高光谱显微成像技术在生物检测中的应用,我们设计和搭建了一套基于液晶滤波器件的能够分别检测透射光谱和荧光光谱(双类型光谱)的高光谱显微成像系统,并通过对光源进行优选和对光学系统结构进行优化,改善了高光谱显微成像系统响应度低的缺点。此外,以胃癌细胞为例,提出了一种能够有效避免生物个体差异所带来的不良影响的癌细胞光谱鉴别方法,通过对判别模型进行改进大大提高了光谱鉴别的准确率和适用性。本文研究内容主要包括:1.理论分析及系统设计。为了实现双类型光谱显微成像以获取更全面的样品信息,在对传统高光谱显微成像系统的结构进行详细分析后,确定采用透射光谱和荧光光谱成像结合的方式构建系统。而为了提高系统的成像质量,本文对系统的响应能力进行了分析研究。高光谱显微成像系统的响应能力与光源能量、曝光时间、放大倍率、CCD灵敏度以及光信号在传输过程中的各种损耗有关,在对这些因素进行了详细分析的基础上,建立了相应的数学模型,提出了改善系统响应的办法,并以此为依据进行了系统设计及优化。2.光源系统设计与搭建。为了分别获得透射光谱成像和荧光光谱成像,系统需要一个照明光源和一个激发光源。本文分别设计和搭建了266 nm、457 nm以及410 nm的激光系统,并对其性能进行了测试,最终选择了光学元件对其吸收损耗小且易于激发荧光的410nm激光作为系统的荧光激发光源。同时,本文采用了能大大提高光收集率的折反式光学系统配合白光LED作为照明光源。通过提高光源光能的利用率,能够增强系统的信噪比,提高系统响应。3.高光谱显微成像系统搭建。根据理论分析和实际情况,采用无穷远平场消色差显微物镜、连续变焦光学成像镜头以及液晶滤波器件等进行了系统搭建。此系统能够分别获得在450-700 nm范围内的透射光谱显微成像和荧光光谱显微成像,其灵敏度高,成像质量好,稳定性强,系统最高光谱分辨率为1 nm,最快的图像获取时间为100.02 ms。4.基于高光谱显微成像系统的花粉检测实验。此实验以玫瑰花的蜂花粉为样本研究了该系统的双类型光谱检测能力。该蜂花粉在常规显微镜中表现为中心有一空洞的颗粒结构。通过本系统进行透射光谱测量,我们发现其中心空洞实际上是一层近乎透明的非均匀的薄膜结构,且通过荧光光谱测量可以确定该薄膜的主要成分与周边组织一致。因此,尽管薄膜以外的组织因太厚而无法进行透射光谱测量,我们仍能在薄膜处获取与花粉其他位置相关的透射光谱信息。这一系列检测结果的获取都是传统光学显微镜或者仅能进行单类型光谱成像的显微系统所不能够实现的。5.基于高光谱显微成像系统的癌细胞鉴别实验。本文以胃癌细胞及正常胃组织细胞样本为例,研究了高光谱图像的信息提取及鉴别技术。由于个体差异,采集于不同病人的样品,其癌细胞所反映出来的光谱特征有较大差异,无明显特征峰存在。本文通过比较分析同一样品内正常细胞和癌细胞的光谱差异,提出了一种以光谱区域划分及区域特征为判别依据的鉴别方法,结合BP网络神经算法实现了对胃癌细胞的智能鉴别,其平均鉴别准确率高达95%。实验证明,采用双类型光谱成像和基于光谱区域划分及区域特征的鉴别方法能够显著改善高光谱显微成像系统的检测能力和适用能力。系统能够发现花粉中的特殊结构,并能对胃癌细胞进行精确鉴别,其相关研究成果对高光谱显微成像技术在生物检测应用领域的发展有着积极的意义。