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目的:探讨蛋白酶体抑制剂左旋紫草素单用及联合顺铂对肺癌细胞系A549体外增殖和凋亡的影响,观察左旋紫草素是否增加肺癌A549细胞对顺铂的敏感性,对相关机理进行初步研究。方法:1.左旋紫草素单用及联合顺铂对纯化的20S蛋白酶体活性的影响对照组:DMSO处理;左旋紫草素组:1umol/L,10 umol/L,20 umol/L;左旋紫草素联合顺铂组: 10umol/L(左旋紫草素)+2ug/ml(顺铂)、10umol/L(左旋紫草素)+4ug/ml(顺铂),10umol/L(左旋紫草素)+8ug/ml(顺铂)利用荧光分度仪,在激发波长:380nm,发射波长:460nm的条件下测定其荧光底物的荧光值,计算出左旋紫草素对20S蛋白酶体活性的抑制率。2.MTT法测左旋紫草素单用及联合顺铂对肺癌A549细胞的生长抑制效应第一组:空白对照组,不给予任何处理;第二组:顺铂组(一系列不同浓度的顺铂);第三组:左旋紫草素组(2、4umol/L);第四组:在第二组基础上联合左旋紫草素(2umol/L);第五组:在第二组基础上联合左旋紫草素(4umol/L)。将细胞接种于96孔板,分别作用24小时后,加入MTT和二甲基亚砜,用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值,根据细胞抑制率公式计算:抑制率=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。3.流式细胞术观察左旋紫草素单独及联合顺铂对肺癌A549细胞凋亡的诱导作用及细胞周期再分布的影响实验分组:对照组;4 umol/L左旋紫草素组;4mg/L顺铂组;4 umol/L左旋紫草素组联合组+4mg/L顺铂组。将细胞处理后上机检测。4. RT-PCR检测切除修复基因-1(ERCC-1)的转录水平实验分组:对照组;4mg/L顺铂组;4mg/L顺铂+2umol/L左旋紫草素联合组;4mg/L顺铂+4umol/L左旋紫草素组联合组。作用24小时后提取总RNA,RT-PCR反应后行琼脂糖凝胶电泳,了解ERCC-1的水平.结果:1.左旋紫草素单用及联合顺铂对纯化的20S蛋白酶体活性的影响左旋紫草素从lumol/L开始即对20S蛋白酶体Chymotrypsin-1iked产生抑制效应,且存在剂量依赖关系,随着剂量增加抑制效应逐渐增加(IC50为12.5 umol/L)。左旋紫草素联合顺铂组与单独用左旋紫草素组对纯化的20S蛋白酶体活性的抑制效应无明显差异。2.MTT法检测肺癌A549细胞抑制率不同浓度顺铂组的抑制率分别为:7.31%±0.49%、12.48%±0.82%、18.26%±1.22%、26.62%±1.34%、35.12%±1.34%。随着顺铂浓度升高肺癌A549细胞抑制率增高,不同浓度顺铂组肺癌A549细胞增殖抑制率差异有统计学意义(P<O.05)。左旋紫草素组的抑制率:22.50%±1.01%、34.12%±1.22%。左旋紫草素(2umol/L)联合顺铂组的抑制率:33.12%±0.86%、39.21%±0.76%、43.19%±0.82%、56.21%±0.54%、62.28%±0.62%。左旋紫草素(4umol/L)联合顺铂组的抑制率: 44.23%±0.16%、49.18%±0.78%、56.32%±1.77%、62.28%±0.54%、80.28%±1.21%。左旋紫草素联合顺铂组肺癌A549细胞的增殖抑制率高于顺铂组及左旋紫草素组,差异有统计学意义(P<O.05),随着左旋紫草素浓度增高细胞的增殖抑制率增高,两联合组间差异有统计学意义(P<O.05)。3.流式细胞术分析肺癌A549细胞凋亡率及细胞周期对照组为3.21%±0.24%;顺铂组为14.46%±1.56%;左旋紫草素组为35.62%±1.37%;左旋紫草素联合顺铂组为58.37%±0.97%。左旋紫草素与顺铂联合能有效诱导肺癌A549细胞凋亡,其诱导的凋亡率高于对照组、顺铂组及左旋紫草素组,差异有统计学意义(P<O.05)。左旋紫草素联合顺铂组S期细胞百分数显著增加,各组细胞周期分布差异具有统计学意义(P<O.05)。4.顺铂和左旋紫草素对肺癌A549细胞ERCC-1转录水平的影响RT-PCR结果显示:顺铂组肺癌A549细胞ERCC-lmRNA相对表达量高于对照组,而顺铂和蛋白酶体抑制剂左旋紫草素联合作用,ERCC-1转录水平较顺铂组降低。结论:1.蛋白酶体抑制剂左旋紫草素可抑制肺癌A549细胞的生长,诱导细胞凋亡,与顺铂联合具有协同抑制效应。2.左旋紫草素可能通过下调ERCC-1转录水平,阻断顺铂诱导的ERCC-l过表达所致的DNA损伤修复,增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性,从而增强顺铂的抗肿瘤作用。