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背景龋病是微生物发酵游离糖产生的酸性副产物对牙齿硬组织造成局部破坏的结果,其相关微生物一直是研究热点。唾液和龈上菌斑是口腔微生物研究的常用样本。但唾液能否代替龈上菌斑来研究龋病相关微生物具有争议性。横断面调查和队列研究都表明患有乳牙龋是第一恒磨牙患龋的危险因素。但是,在第一恒磨牙尚未患龋时,其菌斑微生物群落是否会受乳牙患龋状态的影响,有关这方面的研究甚少。高通量测序技术为微生物研究提供了强有力的支持。新一代测序平台具有短读长的缺点,这对微生物群落的分析具有一定的影响。第三代测序平台如PacBio Sequel弥补了该不足,它能读取全长的16S rRNA基因序列,在鉴定微生物方面具有更精确的“分辨率”,能更好地分析微生物。目的1.评估唾液样本能否代替龈上菌斑样本来研究龋病相关微生物;2.比较7—9岁患龋儿童和健康儿童的微生物群落差异;3.比较7—9岁不同患龋状态儿童的健康第一恒磨牙龈上菌斑微生物群落差异。方法样本取自30名7—9岁儿童的龈上菌斑和非刺激性唾液。15名儿童乳磨牙有龋(龋病组/Caries组/C组),15名儿童无龋(健康组Healthy/H组),所有儿童的第一恒磨牙均无龋。从每名儿童的口腔中收集3种样本并分为6个亚组:CD亚组(C组的乳磨牙龈上菌斑及龋损组织)、CP亚组(C组的第一恒磨牙龈上菌斑)、CS亚组(C组的唾液)、HD亚组(H组的乳磨牙龈上菌斑)、HP亚组(H组的第一恒磨牙龈上菌斑)和HS亚组(H组的唾液)。提取微生物总DNA并扩增全长16S rRNA基因,构建DNA文库,采用PacBio Sequel测序仪进行单细胞实时测序后进行生物信息学分析,具体如下:1.将得到的原始测序数据进行质量控制,获得高质量序列;2.将高质量序列以97%的序列相似度进行分类操作单元(Operational taxonomic unit,OTU)聚类和注释,获得每个OTU在6个分类水平(门、纲、目、科、属和种)的微生物信息;3.对微生物的物种丰富度和均匀度进行alpha多样性分析;4.采用 Linear discriminant analysis Effective Size(LEfSe)分析方法比较亚组间丰度具有差异的微生物,其中线性判别分析(Linear discriminant analysis,LDA)评分阈值设为4.0;5.采用偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)比较亚组间的微生物群落结构的差异性和相似性;6.采用关联网络分析探索微生物间的相互关系。结果1.从90个样本中获得541831条高质量序列,平均每条序列长为1510个碱基对(Base pair,bp),98.39%的高质量序列其长度分布在1401bp—1600bp;2.高质量序列被归并成2495个OTU,经注释获得1 1门,19纲,28目,52科,96属,370种微生物;3.稀疏曲线结果显示本研究的测序深度已经足够反映样本所包含的微生物丰富度和均匀度;物种累积曲线结果显示本研究样本量大小已经足够反映样本总体的微生物丰富度;4.alpha多样性分析结果显示:①患龋儿童与健康儿童间口腔微生物丰富度和均匀度的差异无统计学意义(p>0.05);②在患龋儿童中,乳磨牙和第一恒磨牙龈上菌斑微生物丰富度和均匀度均高于唾液(p<0.05);③在健康儿童中,第一恒磨牙龈上菌斑微生物丰富度和均匀度低于唾液(p<0.05);5.在种的分类水平中,LEfSe分析结果显示:①在乳磨牙龈上菌斑中,变异链球菌、殊异韦荣菌和酸性丙酸杆菌在患龋儿童的丰度高于健康儿童(p<0.05);有害月形单胞菌和马氏棒状杆菌在健康儿童的丰度高于患龋儿童(p<0.05);②在第一恒磨牙龈上菌斑中,有害月形单胞菌在健康儿童的丰度高于患龋儿童;③在唾液中,按照本研究设定的LDA评分阈值(4.0),两亚组间(CS亚组与HS亚组)微生物丰度的差异无统计学意义(p>0.05)。6.PLS-DA结果显示:①在患龋儿童或健康儿童中,乳磨牙龈上菌斑与第一恒磨牙龈上菌斑的微生物群落结构均有少许相似;②在乳磨牙龈上菌斑中,患龋儿童与健康儿童的微生物群落结构完全不同;在唾液中,患龋儿童与健康儿童的微生物群落结构有少许相似;7.关联网络分析结果显示变异链球菌和酸性丙酸杆菌呈正相关关系。结论1.非刺激性唾液样本不能代替龈上菌斑样本研究龋病相关微生物;2.变异链球菌、殊异韦荣菌和酸性丙酸杆菌与乳牙龋密切相关;有害月形单胞菌和马氏棒状杆菌与乳牙的健康密切相关;3.乳磨牙患龋状态不同,健康第一恒磨牙龈上菌斑微生物组成不同。