江苏省部分地区羊消化道寄生虫感染情况调查及两种绵羊球虫PCR检测方法的建立

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羊感染寄生虫十分普遍,羊感染少量或轻度感染寄生虫时临床症状不明显,其危害容易被忽视,当多量或严重感染时会造成羊的贫血、腹泻、营养不良,羊奶、羊肉、皮革等产量和品质下降,从而造成严重的经济损失。此外,有些羊寄生虫是人畜共患寄生虫,可感染人,对人体健康造成危害。羊感染的寄生虫种类及其严重程度,不但与寄生虫的生活史有关,而且与羊的饲养方式有关。近年来在我国羊养殖产业发展迅速,集约化程度不断提高,养殖方式也由过去的放养与散养改为圈养与高床养殖。羊饲养方式的改变,可能会引起寄生虫种类与流行态势的变化。本研究旨在对江苏宿迁、连云港、镇江、南通、徐州、淮安等地规模化养殖场山羊和绵羊消化道寄生虫进行调查,了解感染的寄生虫种类和感染率,尤其是对羊毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)和隐孢子虫(Ctyposporidium spp.)的基因型进行分析,评估其人畜共患风险,同时建立针对两种绵羊球虫的PCR检测方法,为江苏地区羊寄生虫病的防控奠定基础和提供技术手段。1.羊消化道寄生蠕虫与球虫感染情况的调查与分析从江苏宿迁、连云港、镇江、南通、徐州、淮安等地6个规模化养殖场分别采集274份山羊粪便样品和124份绵羊粪便样品,分别用尼龙筛兜淘洗法、饱和盐水漂浮法进行寄生虫检查,从球虫粪检呈阳性的粪便样品中分离球虫卵囊,培养至孢子化卵囊后进行球虫种类鉴定。结果显示,总感染率为91.71%(365/398),其中在山羊中的感染率为91.97%(252/274),在绵羊中的感染率为91.13%(113/124)。在山羊粪便中共查见6种寄生虫,分别是类圆线虫(Strongyloides spp.)、毛圆科线虫(Trichostrongylidae spp.)、莫尼茨绦虫(Moniezia spp.)、毛尾线虫(Trichocephalusspp.)、片形吸虫(Fasciola spp.)和艾美耳球虫(Eimeriaspp.),感染率分别为 24.82%(68/274)、20.44%(56/274)、4.38%(12/274)、1.46%(4/274)、0.73%(2/274)和 91.97%(252/274),艾美耳球虫为优势种;在绵羊粪便中共查见5种寄生虫,分别是毛圆科线虫、莫尼茨绦虫、类圆线虫、毛尾线虫和艾美耳球虫,感染率分别为11.29%(14/124)、11.29%(14/124)、4.84%(6/124)、1.61%(2/124)和 90.32%(112/124),艾美耳球虫为优势种。共鉴定出9种山羊艾美耳球虫,分别是阿氏艾美耳球虫(E.arloingi)、艾丽艾美耳球虫(E.alijevi)、家山羊艾美耳球虫(E.hirci)、柯氏艾美耳球虫(E.christenseni)、山羊艾美耳球虫(E.caprina)、阿普艾美耳球虫(E.apsheronica)、雅氏艾美耳球虫(E.ninakohlyakimovae)、羊艾美耳球虫(E.caprovina)和约氏艾美耳球虫(E.jolohijevi),感染率分别为 74.45%(204/274)、51.09%(140/274)、37.96%(104/274)、29.2%(80/274)、26.28%(72/274)、22.63%(62/274)、21.9%(60/274)、19.71(54/274)和 13.14%(38/274),阿氏艾美耳球虫为优势种;共鉴定出9种绵羊艾美耳球虫,分别是巴库艾美耳球虫(E.bakuensis)、小型艾美耳球虫(E.parva)、类绵羊艾美耳球虫(E.ovinoidalis)、温布里吉艾美耳球虫(E.weybridgensis)、苍白艾美耳球虫(E.pallida)、浮氏艾美耳球虫(E.furei)、槌型艾美耳球虫(E.crandallis)、阿撒他艾美耳球虫(E.ahsata)和错乱艾美耳球虫 12.9%(E.antricata),感染率分别为 54.84%(68/124)、50%(62/124)、41.94%(52/124)、37.1%(46/124)、29.03%(36/124)、24.19%(30/124)、22.58%(28/124)、19.35%(24/124)和12.9%(16/124),巴库艾美耳球虫为优势种2.羊毕氏肠微孢子虫感染情况的调查与分析提取上述粪便样品的基因组DNA,基于ITS序列位点,采用巢氏PCR法对粪便DNA样品进行检测。结果显示,江苏省部分地区羊毕氏肠微孢子虫总感染率11.81%(47/398)。徐州地区的感染率高达21.11%(19/90),南通、镇江、宿迁及连云港地区的感染率分别为 12.5%(5/40)、11.36%(5/44)、10.32%(13/126)、6.1%(5/82),淮安地区未检出。山羊毕氏肠微孢子虫的感染率为8.76%(24/274),基因型为CHG1(7)、CHG3(10)、BEB6(5)、JSX132(1)、COS-I(1),绵羊毕氏肠微孢子虫的感染率为 18.55%(23/124),基因型为 CHG1(1)、BEB6(18)、JSX164(2)、COS-I(1)、CHC8(1),其中JSX132和JSX164为本次调查发现的新基因型。种系发育树显示本次检测到的基因型均属于Group 2亚群。3.羊隐孢子虫感染情况的调查与分析基于SSU rRNA基因位点,采用巢氏PCR法对上述粪便DNA样品进行检测。结果显示,江苏省部分地区羊隐孢子虫总感染率为0.75%(3/398),仅在南通地区检出3例阳性样本,感染率为7.5%(3/40),其余地区均未检出。山羊隐孢子虫的感染率为1.09%(3/274),绵羊隐孢子虫的感染率为0.0%(0/124),种系发育树显示3个阳性隐孢子虫虫种均为肖氏隐孢子虫。4.两种绵羊球虫PCR检测方法的建立根据GenBenk中已公布的小型艾美耳球虫和类绵阳艾美耳球虫ITS-1序列,设计两对种特异性引物,优化反应条件,并对特异性、敏感性进行研究。结果显示,针对小型艾美耳球虫的种特异性引物能扩增出大小为176bp的特异性条带,针对类绵羊艾美耳球虫的种特异性引物能扩增出大小为300bp的特异性条带,对其他绵羊球虫和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、火鸡组织滴虫(Histomonas meleagridis)、隐孢子虫扩增均为阴性,其最小检测浓度为0.1 ng,显示建立的方法有种特异性和敏感性。结论:在江苏6个规模化养殖场,羊消化道寄生虫感染率为91.71%,存在6种寄生虫感染,优势种是艾美耳球虫;毕氏肠微孢子虫总感染率为11.81%,存在7种基因型,其中2种为新基因型;隐孢子虫总感染率为0.75%,均为肖氏隐孢子虫。建立了小型艾美耳球虫和类绵羊艾美耳球虫的PCR检测方法,其最小检出量为0.1 ng。
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