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DNA双链断裂(Double strand breaks, DSBs)是一种非常严重的DNA损伤。DSBs如果不能修复则可能导致染色体的断裂以及细胞死亡,若修复不当可能致使染色体发生缺失、易位和倒位等重排,从而易于导致肿瘤等相关疾病。生物体存在多种DNA修复系统以保证基因组的完整性。DSBs的主要修复方式有同源重组修复(Homologous recombination repair, HRR)和非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复,其中同源重组修复是S期DSBs修复最主要的方式。当DNA发生了双链断裂(DSBs),基因组内序列相同的DNA即可被当作模板来修复断裂。真核细胞中的RAD51蛋白是DNA同源重组修复中的关键性蛋白质。RAD51在人类多种肿瘤细胞中高表达,而RAD51的高表达可能致使肿瘤产生耐药性。因此如何有效的下调细胞内RAD51的水平从而使提高肿瘤的治疗效果是目前需要解决的问题。MicroRNA (miRNA)是近年来在多种真核细胞以及病毒中发现的微小的非编码单链RNA。microRNA基于与靶基因mRNA的序列部分或全部互补对靶基因进行转录后的表达调控。microRNA被发现作用于DNA损伤修复网络的许多环节,因此寻找能够参与调控DNA修复的miRNA以及其调控靶点非常重要。我们通过软件预测发现miR-221可能作用于RAD51mRNA。我们通过高表达或抑制miR-221验证了miR-221对RAD51的负调控,发现miR-221可降低DNA同源重组修复的效率以及基因组稳定性。miR-221造成肿瘤细胞在药物处理下的生存率降低。[研究目的]本课题研究了人类骨肉瘤细胞(U2OS)中,miR-221对RAD51的调控作用,并研究其在细胞增殖、DNA双链断裂修复以及细胞对化疗药物敏感性等方面的作用。[研究方法]生物信息学软件预测可能作用于RAD51的microRNA,筛选出候选miR-221。利用慢病毒转染将miR-221导入人类成骨肉瘤(U20S)细胞,建立稳定表达miR-221的细胞系,利用Western blotting检测miR-221对细胞中RAD51蛋白水平的影响。构建含RAD51mRNA3’UTR的荧光素酶报告系统,研究miR-221对RAD51的负调控。通过免疫荧光方法检测DNA双链损伤标记γ-H2AX及同源重组修复过程中的关键步骤RAD51焦点形成。通过计数微核发生评估基因组不稳定性。利用MTT法检测药物处理后细胞生存率。[实验结果]1. Western blotting结果表明转染miR-221的成骨肉瘤U2OS细胞中RAD51蛋白水平明显下调。2.X射线照射后,miR-221转染细胞中RAD51焦点数目少于对照(.miR-neg),表明同源重组修复过程受阻。3.使用电离辐射处理细胞,发现miR-221细胞组γ-H2AX阳性细胞比例数高于miR-neg细胞组,表明转染miR-221后DNA双链断裂的修复受阻。同时miR-221组γ-H2AX阳性微核频率也高于miR-neg组,表明miR-221导致基因组不稳定性升高。4.含RAD513’UTR的荧光素酶报告基因显示,转染miR-221之后荧光素酶表达量下降,表明miR-221可负调控RAD51。5.转染miR-221抑制剂到U2OS细胞中,检测RAD51蛋白表达,结果显示在miR-221表达受到抑制时RAD51的表达量上升。6.miR-221细胞在羟基脲、PARP抑制剂的处理下生存率与对照组(miR-neg)相比有明显的下降。[结论]miR-221能显著下调RAD51,并且能增加细胞对于DNA损伤诱导药物羟基脲、PARP抑制剂的敏感性。miR-221能够阻碍同源重组,并使基因组稳定性下降。