持留菌是细菌群体中对抗生素具有耐受性的非遗传表型,通常占细菌总数的10-4-10-6,是导致细菌耐药的主要原因之一。在多药耐受持留菌的形成过程中,毒素—抗毒素系统（toxin-antitoxin system,TA系统）发挥重要作用。因此,阐明TA系统在持留菌形成过程中的作用机制有望为解决细菌耐药问题提供新的思路,TA系统可作为新型的抗菌药物靶标,以缓解持留菌导致的慢性感染性疾病和细菌耐药问题。蛋白质作为生理功能的主要执行者,蛋白水平研究对于解析TA系统与持留菌形成的关系至关重要。TA系统包含毒素和抗毒素两个同源分子,毒素干扰细菌复制、翻译、分裂等生命过程,抗毒素则中和毒素。TA系统相关蛋白的表达量低,细菌中毒素蛋白数量最多不超过100个拷贝,少则低至几个,且TA系统在不同细菌间存在明显的差异性表达;而持留菌由群体中极少数细菌表型变异产生,丰度极低,研究难度大。因此,如何在单细菌水平揭示TA系统异质性表达与低丰度持留菌形成的关系是目前的研究难点。本论文基于课题组研制的纳米流式检测装置（nano-flow cytometer,nFCM）高通量、高灵敏、多参数的单颗粒检测优势,结合双砷染料—四半胱氨酸体系和免疫荧光技术,发展了 TA系统单细菌水平研究方法,实现对单个细菌中毒素和抗毒素蛋白的检测,并基于该方法开展TA系统表达与持留菌的形成的单细菌水平研究,主要内容如下:第一章为文献综述,主要介绍了 TA系统在多药耐受持留菌形成中的作用,以及TA系统与持留菌形成的研究现状,提出了单细菌水平研究的重要性,对本论文的研究思路和研究内容进行阐述。第二章为单细菌水平毒素蛋白表达与持留菌形成关系的研究。以MqsR/MqsATA系统作为研究对象,利用nFCM结合双砷染料—四半胱氨酸体系标记毒素蛋白MqsR,成功实现对天然启动子调控下毒素蛋白MqsR的单细菌水平检测。基于nFCM-TC-FlAsH法,我们对利福平（RIF）诱导持留菌形成过程中毒素蛋白MqsR的表达情况进行检测,发现RIF作用0.5 h后细菌群体中出现毒素蛋白MqsR高表达亚群。对该样品进行持留菌分离纯化,发现提纯后的持留菌MqsR的表达峰与阴性对照相比发生明显右移,证明高表达MqsR毒素蛋白的细菌即为持留菌。此外,持留菌中高表达的MqsR毒素蛋白也明显分为两个亚群,次高和高表达亚群比例分别为39.7%和60.3%,荧光中位值分别为529.7和2030.3,这是首次发现持留菌中高表达的毒素蛋白存在异质性现象。抗生素滥用使得体内或环境中的细菌累积抗药因子发生细菌耐药进化。为探究TA系统在这个过程中的作用,我们延长RIF作用时间,分别对作用0.5、3、12、24h的细菌进行分析,发现0.5 h和24 h时MqsR毒素蛋白出现高表达亚群,而3 h和12h时未出现高表达亚群,仅MqsR表达峰发生整体略微右移。为探究MqsR高表达亚群的可能机制,我们检测了 RIF作用不同时间的细菌持留情况,发现细菌的持留菌比例随RIF作用时间延长而增加,且与高表达亚群没有关联。进一步,对RIF作用不同时间的细菌进行抗生素循环诱导细菌耐药实验,发现存在MqsR毒素蛋白高表达亚群的RIF作用0.5 h和24 h的细菌更快发生细菌耐药;RIF作用12 h的细菌也在多次循环诱导后发生细菌耐药,推测可能的原因是其整体MqsR表达水平高。以上研究结果表明毒素蛋白表达与细菌耐药进化密切相关。本章通过对毒素蛋白的单细菌水平检测,揭示细菌通过调节毒素蛋白的异质性表达来促进持留菌形成,并进一步促进细菌耐药进化。第三章开展了单细菌水平毒素蛋白与抗毒素蛋白的同时检测,并探究毒素/抗毒素相对含量与持留菌形成关系。分别采用双砷染料—四半胱氨酸体系和免疫荧光技术标记毒素MqsR和抗毒素MqsA,结合nFCM建立nFCM双荧光法,实现对毒素蛋白和抗毒素蛋白的单细菌水平同时检测。采用RIF诱导持留菌形成,nFCM双荧光法检测RIF作用下毒素蛋白和抗毒素蛋白的变化。我们发现RIF作用下细菌的MqsR蛋白含量增加,MqsA蛋白含量减少,结果表明细菌同时调控TA系统中毒素与抗毒素的表达使得毒素/抗毒素相对含量增加,从而导致细菌形成持留菌。细菌在四环素和CCCP作用下通过提高毒素/抗毒素比例来调控持留菌形成,但由于毒素/抗毒素比例变化较小,其持留菌比例增加也较小。此外,在长期的RIF作用下,细菌中MqsA抗毒素含量持续下降,而MqsR毒素蛋白含量持续增加。基于以上研究结果,我们得到TA系统介导持留菌形成的可能机制:细菌同时调节毒素与抗毒素表达,部分细菌高表达毒素蛋白且降解抗毒素蛋白,使毒素/抗毒素相对含量增加,促进持留菌的形成。第四章为总结与展望。总结了本论文的研究结果,提出后续的研究方向。