目的：明确目标人群中支气管粘膜上皮中Ezrin的表达特征。探讨Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及在黏液分泌中的作用。在细胞模型中进一步研究Ezrin与参与气道上皮细胞黏液分泌出胞动作的相关信号分子之间相互作用，详细探讨Ezrin/PIP2/MARCKS分子信号链参与气道黏液分泌的过程，以期明确Ezrin参与气道黏液分泌调控的具体分子机制及信号传导通路。方法：（1）Ezrin在目标人群支气管粘膜上皮中的表达情况：收集外科行肺叶切除术患者支气管粘膜组织，采用免疫组织化学方法检测Ezrin蛋白的表达水平及其分布特点，用Imagepro-plus6.0软件进行图像分析比较慢性气道炎症患者与正常人气道粘膜上皮组织中的表达差异，并进一步采用Western bolt法及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）法分别检测慢性气道炎症患者与正常人气道粘膜上皮组织中Ezrin的蛋白及mRNA的表达差异。（2）Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及其促黏液分泌效应研究：获得野生型及关键作用位点Thr567定点突变的Ezrin重组质粒（pEGFP-N1-ezrin-Wt、 pEGFP-N1-ezrin-T567D、 pEGFP-N1-ezrin-T567A），经酶切鉴定验证后，转染16HBE细胞，取得具有EGFP标记的Ezrin T567D、T567A、Wt以及pEGFP-N1对照组的系列细胞株，为后续功能对照研究提供基础。体外培养人气道上皮16HBE细胞，以不同浓度人嗜中性细胞弹性蛋白酶（human neutrophil elastase，HNE）刺激细胞，MTT法检测其对细胞活力的影响，real-time PCR法检测经刺激物作用后MUC5AC mRNA表达水平，酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测细胞上清液及细胞裂解液中的MUC5AC蛋白含量，从而选取HNE的最适浓度。以最适浓度的HNE刺激转染野生型Ezrin及Ezrin各型突变体的16HBE细胞，ELISA法比较HNE作用后各组细胞MUC5AC蛋白含量的差别，同时采用Western blot法比较培养细胞中不同突变体中磷酸化Ezrin蛋白的含量，明确Thr567位点的不同突变体对MUC5AC分泌影响的差异，推断出其在黏液分泌中的关键作用。（3）Ezrin与胞吐相关蛋白的定位及相互作用研究：分别将新霉素（PLC特异性抑制剂，可抑制PIP2水解）和CalphostinC（PKC特异性抑制剂）作用于16HBE细胞，Western blot法检测细胞中磷酸化Ezrin的含量，同时应用免疫细胞化学染色，激光共聚焦显微镜观察PIP2和Ezrin的表达及细胞定位情况，以期明确PIP2和PKC对Ezrin磷酸化及顶膜定位的影响。与此同时，培养的人气道上皮细胞转染野生型、Thr567位点各型Ezrin突变体及对照后，分别予以HNE刺激，Western blot检测细胞中磷酸化MARCKS的含量，观察Ezrin对MARCKS磷酸化的影响。最后，将16HBE细胞转染野生型、PSD突变的MARCKS及对照后，予以HNE刺激后，ELISA检测胞外分泌的MUC5AC蛋白表达水平，以期明确MARCKS对MUC5AC蛋白分泌的影响。结果：（1）Ezrin在目标人群支气管粘膜上皮中的表达情况：免疫组化结果显示磷酸化Ezrin蛋白阳性染色细胞位于支气管粘膜上皮内，集中表达于纤毛富集的支气管粘膜上皮细胞的细胞膜顶端靠腔面侧，呈棕黄色。用Imagepro-plus6.0软件进行图像分析，把黄色区域作为评定区（area of interest，AOI），结果发现：COPD组的支气管粘膜上皮累积光密度/面积（integrated optical density/area，IOD/area）值（0.28±0.049）显著高于正常对照组（0.19±0.036），P <0.05，差异有统计学意义。real-time PCR结果显示：COPD组支气管粘膜内Ezrin mRNA相对表达量为对照组的1.18±0.071倍，与正常对照组相比无显著性差异（P>0.05）。Western-blot结果显示：COPD组支气管粘膜内磷酸化Ezrin蛋白表达量显著高于正常对照组（P <0.05)，差异有统计学意义。（2）Ezrin在体外培养的气道上皮细胞中的表达及其促黏液分泌效应研究：Ezrin重组质粒经XhoI-BamH I的双酶切鉴定，各质粒的酶切结果与预期的一致，确证有目的DNA片段产生，可以进行后续实验。将上述pEGFP-N1-Ezrin重组质粒与空质粒分别转染到16HBE细胞，24-48h在荧光倒置显微镜下观察四组质粒均发出绿色荧光，说明转染成功。分别予以不同浓度HNE作用于16HBE细胞，MTT检测发现0.01、0.1、0.5μM HNE组与对照组相比细胞增殖活力无明显差异，1μM HNE组从第30min开始吸光度降低，较对照组显著下降（P<0.05）。各浓度梯度HNE刺激下MUC5AC mRNA及蛋白表达均呈剂量依赖性增加，0.5μM HNE组增加尤为明显(P<0.01)，其余各浓度组与对照组相比亦有增加（均P<0.05）。故后续实验中，可选取0.5μM作为HNE的最适浓度来刺激细胞。转染了Ezrin Thr567位点的不同突变体的16HBE细胞予以HNE刺激，Western blot及免疫荧光结果显示：HNE能诱导稳定转染野生型Ezrin的16HBE细胞中Ezrin Thr567位点磷酸化蛋白表达水平的升高（与阴性对照组相比P<0.05）及向细胞膜的顶膜定位，与vehicle对照组相比，pEGFP-N1-Ezrin-T567D组细胞中磷酸化Ezrin蛋白含量明显增高（P<0.05），分布亦仅集中在胞膜，而pEGFP-N1-Ezrin-T567A组细胞中磷酸化Ezrin蛋白表达则明显降低（P<0.01），无明显向胞膜聚集的趋势，pEGFP-N1-Ezrin-Wt组细胞中磷酸化Ezrin蛋白表达略有升高，但差异无统计学意义（P>0.05）；ELISA结果显示：与阴性对照组相比，0.5μM HNE刺激转染Ezrin各型突变体的各组细胞后胞外分泌和胞内储存的MUC5AC蛋白含量均明显升高（P<0.05），与vehicle对照组和野生型Ezrin组相比，pEGFP-N1-Ezrin-T567D组细胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白含量显著增高（P<0.01），细胞内的MUC5AC蛋白含量则明显减少（P<0.05），与此相对应的pEGFP-N1-Ezrin-T567A组细胞分泌出胞外的MUC5AC蛋白较vehicle对照组减少（P<0.01），而细胞内的MUC5AC蛋白较vehicle对照组增加（P<0.05）。（3）Ezrin与胞吐相关蛋白定位及相互作用研究：予以Calphostin C预处理16HBE细胞后再予以HNE刺激16HBE细胞，Western blot结果显示：PKC特异性抑制剂Calphostin C明显抑制HNE诱导的Ezrin Thr567位点磷酸化蛋白和MARCKS磷酸化蛋白表达，与HNE组相比有统计学差异（P<0.05），与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。使用PLC的特异性抑制剂新霉素后，抑制HNE诱导的PLC对PIP2水解，胞膜上PIP2增多，但免疫荧光和激光共聚焦检测显示磷酸化Ezrin蛋白的减少以及胞膜定位的pEzrin较HNE组减少，未能实现顶膜定位。16HBE细胞转染野生型、Thr567位点各型Ezrin突变体及对照质粒后，分别予以HNE刺激，Western blot显示与vehicle对照组和野生型Ezrin转染组相比，pEGFP-N1-Ezrin-T567D组细胞pMARCKS的含量明显增加（P<0.05），而pEGFP-N1-Ezrin-T567A组则明显减少（P<0.05）。将pCDNA3.0载体、PSD-mutant-MARCKS质粒、野生型MARCKS质粒稳定转染16HBE细胞后发现转染PSD-mutant-MARCKS的HNE处理组细胞MUC5AC分泌明显减少（与野生型MARCKS组相比，P<0.05）。