目的:本课题以食管癌（human esophageal cancer,HEC）细胞KYSE180和KYSE450作为研究对象,揭示乙酰紫草素诱导内质网应激的信号通路,并阐明内质网应激与乙酰紫草素诱导的食管癌细胞凋亡之间的关系,为乙酰紫草素作为抗食管癌的潜在药物提供科学依据。方法:1.本实验以食管癌细胞为研究对象,首先利用不同的浓度的乙酰紫草素（0,0.625,1.25,2.5,5,10和20μM）分别作用于食管癌细胞KYSE180、KYSE450、KYSE510、EC109、EC9706和TE10六种细胞系,观察24小时后细胞的增殖情况,通过CCK-8法检测细胞存活率,并计算半数抑制率IC50以确定乙酰紫草素敏感株以及乙酰紫草素的最佳作用浓度。2.1000个/孔KYSE180细胞接种至六孔板,过夜。利用不同浓度的乙酰紫草素（0,0.15,0.3,0.6,1.2和2.4μM）作用KYSE180细胞24小时后更换为完全培养基继续培养,每隔2天进行换液,实验持续两周,经甲醇固定,吉姆萨染色后,计算克隆数,阐明乙酰紫草素对KYSE180细胞克隆形成的影响。3.2.0×105个/孔KYSE180和2.5×105个/孔KYSE450细胞接种至六孔板,待其贴壁。不同浓度的乙酰紫草素（0,1,2,4和6μM）处理KYSE180细胞;对于KYSE450细胞乙酰紫草素的浓度为0,1,2,3和4μM,24小时后,收集细胞,4°C预冷的PBS缓冲液洗涤两遍,用70%乙醇4°C静置过夜固定,离心去除乙醇,加入含有50 mg/L RNase A和50 mg/L PI染料的PBS缓冲液,37°C避光孵育30 min,用40μm细胞过滤筛过滤后,通过流式细胞仪进行细胞周期检测。4.收集经不同浓度乙酰紫草素处理的KYSE180细胞和KYSE450细胞,PBS缓冲液洗涤两遍后,Annexin V-FITC/PI双染,避光孵育15 min,通过流式细胞仪检测细胞凋亡。5.利用不同浓度的乙酰紫草素作用于KYSE180细胞及KYSE450细胞24小时或者利用一确定浓度的乙酰紫草素作用于KYSE180细胞及KYSE450细胞不同时间,通过Western Blotting方法检测凋亡相关蛋白以及内质网应激反应相关蛋白的表达。6.构建荷瘤裸鼠模型,腹腔注射不同浓度的乙酰紫草素,通过观察肿瘤体积大小、重量和小鼠体重变化检测乙酰紫草素在体内的抗肿瘤活性。7.将裸鼠肿瘤组织采用常规方法进行病理制片,通过苏木素-伊红（HE）染色和免疫组织化学法染色检测,镜下观察肿瘤组织的病理特征。8.不同浓度乙酰紫草素处理后的KYSE180和KYSE450细胞,提取细胞总RNA,经RT-PCR得到的c DNA或通过Real-time PCR检测内质网应激相关基因表达或利用XBP1特异引物进行常规PCR,产物经酶切检测XBP1是否激活。结果:1.乙酰紫草素呈剂量和时间依赖性的抑制食管癌细胞KYSE180、KYSE510、EC109、EC9706、TE10和KYSE450细胞的活力。乙酰紫草素对各食管癌细胞的IC50介于1.69～13.25μM之间,其中KYSE180细胞和KYSE450细胞的IC50值小于其他细胞系,分别为3.72和1.69μM,提示KYSE180细胞和KYSE450细胞对乙酰紫草素更加敏感。2.乙酰紫草素显著抑制KYSE180细胞的克隆形成能力,并呈剂量依赖性。对照组的克隆数可达301个,而当乙酰紫草素浓度达1.2μM时,KYSE180细胞几乎无法形成克隆。3.乙酰紫草素有效的使食管癌KYSE180和KYSE450细胞的周期发生不同程度的阻滞。其中,KYSE180细胞在低浓度乙酰紫草素处理后,G1期阻滞比较明显,而中高浓度的乙酰紫草素以诱导S期阻滞为主;KYSE450细胞在低浓度乙酰紫草素处理时以S期阻滞为主,但中高浓度的乙酰紫草素却表现出G1期阻滞。表明了乙酰紫草素可以通过阻滞KYSE180细胞和KYSE450细胞细胞周期的方式抑制其增殖。4.乙酰紫草素使KYSE180细胞和KYSE450细胞形态均发生明显改变。细胞失去原有的贴壁形态,出现皱缩、变圆、脱落悬浮,并呈剂量依赖性增加。通过流式细胞术检测,经不同浓度的乙酰紫草素处理24小时后,KYSE180细胞和KYSE450细胞凋亡率均呈剂量依赖性地显著增加。以上结果表明,乙酰紫草素可显著诱导食管癌细胞凋亡。5.通过Western blotting检测了凋亡相关蛋白的表达显示,当乙酰紫草素浓度为2μM时,KYSE180细胞和KYSE450细胞内的PARP开始出现明显的剪切形式,并呈浓度依赖性增加,而cleaved caspase-3则在3μM以上的乙酰紫草素处理24小时后开始显著激活。以上结果表明,乙酰紫草素能够以时间和剂量依赖性的方式诱导食管癌细胞的凋亡。但是促凋亡蛋白BAX变化并不明显,可能并未参与乙酰紫草素诱导的细胞凋亡。6.乙酰紫草素作用于食管癌KYSE180细胞构建的裸鼠成瘤模型,结果显示,随着给药时间延长,乙酰紫草素处理组与对照组的肿瘤体积差异越显著,平均肿瘤重量显示,乙酰紫草素可显著降低肿瘤重量,并表现出剂量依赖性降低。然而实验组小鼠的体重在经过乙酰紫草素处理10天后开始略有下降,具体机制还需进一步研究。7.将肿瘤组织进行HE染色和免疫组织化学法检测。乙酰紫草素处理后,肿瘤组织中Ki67的表达显著降低。提示随着乙酰紫草素浓度增加,食管癌细胞增殖能力减弱。与对照组相比,随着乙酰紫草素浓度增加,肿瘤组织中内质网应激相关蛋白BIP、CHOP的表达也随之增加,提示乙酰紫草素可能通过内质网应激诱导肿瘤细胞的凋亡。8.Western blotting检测了一系列内质网应激相关蛋白的表达水平。结果表明,内质网应激的标志蛋白BIP随着乙酰紫草素的处理而显著上调,呈时间、剂量依赖性。p-e IF2α（S51）在乙酰紫草素处理1小时后就显著上调,一直持续近24小时。说明乙酰紫草素激活了内质网应激中的PERK/e IF2α信号通路。此外,乙酰紫草素处理后,KYSE180和KYSE450细胞内,IRE1α,Ero1-Lα,CHOP和PDI的蛋白水平显著增加,而Calnexin的表达水平却显著下降。9.随着乙酰紫草素浓度的增加,KYSE180和KYSE450细胞中无法被Pst I酶切的XBP1逐渐增加。表明乙酰紫草素可以激活IRE1/XBP1信号途径。10.通过Real-time PCR方法检测了乙酰紫草素处理后内质网应激相关的基因表达,除了BIP外,CHOP,ATF3,ATF4的表达均呈剂量依赖性上调,其中ATF3和CHOP上调的幅度最为显著,但ATF6变化不明显。乙酰紫草素可能通过内质网应激上调ATF3和CHOP表达,促进细胞凋亡,具体机制还需进一步研究。结论:1.乙酰紫草素显著抑制食管癌各细胞系的增殖,其半数抑制浓度IC50介于1.69～13.25μM之间,并诱导细胞周期阻滞,抑制肿瘤细胞的克隆形成能力。2.乙酰紫草素可激活caspase-3,促进PARP剪切,诱导细胞凋亡,但BAX变化不明显,提示乙酰紫草素诱导的细胞凋亡可能并不需要BAX的参与。3.乙酰紫草素显著抑制荷瘤裸鼠体内肿瘤的增殖,减小肿瘤体积,降低肿瘤重量。4.乙酰紫草素诱导食管癌细胞内质网应激,上调BIP、PDI等表达,下调Calnexin的表达,并激活PERK/e IF2α和IRE1/XBP1途径,从而诱导ATF3和CHOP的表达,诱导细胞凋亡。