氨基葡萄糖(GlcN)及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作为营养化学品及药品被广泛应用于维持骨关节健康以及治疗骨关节疾病。GlcN和GlcNAc在延长细胞寿命方面新作用的发现进一步扩展了其应用范围。然而,目前GlcN和GlcNAc的生产方法甲壳素水解法,存在原料来源质量不稳定、生产过程污染环境和虾蟹壳甲壳素来源产品易引起过敏等诸多显著不足。因此,开发一种可持续、环保的方法来生产符合食品药品安全级别的GlcN和GlcNAc成为一项亟待解决的课题。本论文以食品安全级产品生产菌株枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)作为出发菌株,采用代谢工程方法结合合成生物学工具以及系统生物学分析方法构建了一株可以高效合成GlcNAc的B.subtilis工程菌。本论文主要研究内容如下:(1)采用理性代谢工程手段,在B.subtilis 168中共表达GlcN-6-P合成酶(GlmS)和GlcN-6-P乙酰化酶(Gna1),成功构建了GlcNAc合成途径,实现了GlcNAc在B.subtilis中积累,产量达到240 mg/L;进一步敲除磷酸转移酶系统GlcNAc特异性蛋白编码基因nagP,阻断了胞外GlcNAc转运至胞内过程,胞外GlcNAc产量进一步提升至615 mg/L;进一步敲除GlcNAc-6-P脱乙酰酶(NagA)、GlcN-6-P脱氨基酶(GamA和NagB)的编码基因,完全阻断GlcNAc分解代谢途径,摇瓶发酵GlcNAc产量达到1.85 g/L。(2)在已构建的重组B.subtilis基础上,进一步利用基于DNA介导支架的合成生物学工具,对GlcNAc合成途径关键酶GlmS和Gna1进行空间和比例上的调控,当GlmS和Gna1以1:2的比例被DNA介导支架结构固定在空间上相互靠近的位置时,GlcNAc产量提高至4.55 g/L。通过对上述工程菌的呼吸链进行改造,阻断低效醌醇氧化酶分支途径呼吸链,使细胞利用高效呼吸链提高细胞能量利用效率,进而使细胞维持代谢系数降低19.0%,GlcNAc产量比呼吸链改造前提高39.6%,达到6.15 g/L。(3)利用模块途径工程系统组装和调控GlcNAc合成模块、糖酵解途径模块以及肽聚糖合成途径模块,优化代谢流分配、提高GlcNAc合成效率。首先,采用双启动子系统优化GlcNAc合成途径中GlmS和Gna1表达,严谨诱导型启动子PxylA调控GlmS表达,组成型启动子P43调控Gna1表达时,摇瓶水平发酵单位细胞GlcNAc产率达到0.42 g GlcNAc/g DCW;然后,通过表达anti-pfk sRNA、anti-glmM sRNA和Hfq蛋白,控制GlcNAc合成、糖酵解及肽聚糖合成途径分别在高活性水平、低活性水平和低活性水平时,单位细胞GlcNAc产率最高,达到2.00 g GlcNAc/g DCW;最后,BSGN9-S2在3-L发酵罐分批发酵和补料分批发酵,GlcNAc产量分别达到9.41 g/L和31.65 g/L。(4)运用靶向代谢组学技术分析GlcNAc生产菌株中心代谢产物谱,并系统解析GlcNAc合成对细胞代谢的影响及稳态条件下GlcNAc合成途径的代谢物浓度。结果表明,GlcNAc生产菌株中心碳代谢、氮代谢及氨基酸代谢的胞内代谢物浓度均低于野生型菌株。GlcNAc生产菌株中谷氨酰胺(Gln)浓度降低73.8%,消耗氨基供体Gln被鉴定为导致胞内代谢物浓度水平降低的主要原因。GlcNAc合成途径中代谢物浓度分析表明,中间代谢物GlcNAc-6-P显著积累,GlcNAc-6-P胞内浓度达到33.71 mM。因此,GlcNAc合成途径中存在某一限速步骤,致使胞内GlcNAc-6-P异常积累。(5)结合动力学模拟以及动态代谢组学对GlcNAc合成途径中潜在限速步骤进行了鉴定。将GlcNAc合成途径动态代谢组学与动力学模拟结果比较,结果表明实验测定的GlcNAc合成途径动力学特征符合当GlcNAc-6-P与胞内GlcNAc之间存在无效循环时的模拟动力学特征。因此,GlcNAc-6-P与胞内GlcNAc之间存在无效循环为GlcNAc合成途径潜在限速步骤。进一步通过[U-13C]葡萄糖动态标记实验以及重组菌BSGNK构建,证实了GlcNAc-6-P与胞内GlcNAc之间无效循环的存在。通过敲除重组菌BSGN中葡萄糖激酶编码基因glcK,无效循环得以解除。阻断无效循环降低了胞内GlcNAc-6-P的积累,促进了细胞生长和GlcNAc合成,细胞比生长速率和GlcNAc生产强度分别是阻断前的2.1倍和2.3倍。