原代培养相比于临床上常用的细胞株更好地保留了细胞的原始生物学特性,更能反映体内细胞的生理病理状态,故利用原代细胞为基础探索相关疾病及其发病机制已成为体外研究的一种理想工具,越来越受到人们的重视。近年来,生物医学各种以正常原代细胞为基础的研究逐年增多,各种组织的原代培养的相关研究逐渐成为国内外学者关注的焦点。正常宫颈上皮细胞原代培养对于深入研究人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)在宫颈癌中的作用机制至关重要。然而,对于正常宫颈上皮细胞原代培养方法的研究很少,急需寻找一种高效、可重复性高的宫颈细胞分离及体外培养的方法。宫颈原代上皮细胞分离培养常见的方法有组织块培养法和酶消化后培养法。组织块培养,虽然操作简便,但细胞培养成功率较低,容易导致成纤维细胞和微生物的污染。酶消化法能够特异性的消化相应细胞,使组织分离为单细胞悬液,比组织块法更加高效,但对细胞易造成损伤而影响细胞数量和质量。分离原代细胞常用的消化酶有胰酶、?型胶原酶、Ⅱ型中性蛋白酶联合胰酶,培养基主要有单纯无血清培养基和基础培养基添加EGF、胰岛素、氢化可的松等生长因子,然而不管是目的细胞分离技术还是培养基成分的选择都均存在欠缺,如:分离步骤繁琐、细胞纯度不高、细胞活性欠佳等。基于病毒的转染方法已成为实现难以转染的原代细胞和细胞系的基因表达最成功的方法,几乎适用于所有类型的细胞和原代细胞的转染,成为了外源基因感染细胞最有效的工具。病毒载体的合理选用对保证病毒转染的转染效果至关重要,其中,慢病毒载体(lentivirus vector,LV)介导的外源基因的转染,能够转染分裂和非分裂期细胞,并且能够与宿主基因组发生整合,维持长久的基因表达能力,使得慢病毒载体为外源基因转导的体外研究提供了一个新的平台。本研究的目的在于通过不同的酶消化分离方法、不同的培养基培养的比较,建立一种更优的原代正常宫颈上皮细胞培养体系。并利用重组慢病毒感染原代宫颈细胞,初步建立一个感染HPV E6的体外细胞模型,为后续原代宫颈细胞感染HPV的致癌机制的研究奠定坚实的基础。方法1.本研究的所有标本均来源于郑州大学第三附属医院2015年9月至2016年9月妇科住院部因良性子宫病变(如多发性子宫肌瘤、子宫腺肌症等)进行子宫全切术患者的正常宫颈组织,年龄38-60岁(中位年龄46岁)。患者及家属均知情同意并签署同意书。所有标本术前检查HPV及液基细胞学(Liquid based cytology,LBC)均阴性,术后组织病理学结果证实宫颈组织无异常病变。本研究共收集标本90例,分为2组,一组为Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰酶-EDTA组45例,另一组为?型胶原酶组45例,分别进行宫颈组织的分离及原代培养。2.分别采用Ⅱ型中性蛋白酶联合0.25%胰酶-EDTA及?型胶原酶消化分离细胞后进行原代培养,比较两种酶的分离效果,以及中性蛋白酶联合法不同消化时间对分离效果的影响;通过生长曲线比较添加5%FBS的d KSFM培养基与单独d KSFM培养基培养原代宫颈上皮细胞的生长效果,并通过观察细胞形态学特点,及免疫细胞化学、免疫细胞荧光角蛋白染色共同鉴定细胞来源。3.体外扩增HPV16 E6基因,经酶切连接到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体并通过293T细胞进行慢病毒包装,感染原代人正常宫颈上皮细胞。感染48h后倒置荧光显微镜下观察HPV16 E6基因绿色荧光蛋白(cop GFP)荧光表达,q RT-PCR检测感染后HPV16 E6 mRNA的表达水平。统计分析采用SPSS 21.0软件完成数据统计分析。以?x±s表示实验的计量资料,采用χ2检验进行两种分离方法的成功率和细胞纯度的比较,采用两独立样本t检验进行分离细胞密度、原代细胞融合时间、细胞贴壁率的比较。中性蛋白酶不同消化时间对分离效果的比较采用方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验,两两比较采用Boffrroni检验。采用两独立样本定量资料t检验进行两种培养基培养的细胞增殖活性(OD值)的比较。采用非参数Kruskal-Wallis检验进行感染组、感染对照组、未感染组间HPV16E6 mRNA表达水平的差异分析,组间比较采用Bonferroni检验。所有统计学分析均采用双侧检验,检验水准α=0.05。结果1.正常宫颈上皮细胞原代培养总成功率为42.2%。Ⅱ型中性蛋白酶联合消化法成功率高于?型胶原酶法(P<0.05),分离所得细胞密度、原代细胞融合时间、细胞贴壁率及细胞纯度均高于?型胶原酶消化法(P<0.001)。中性蛋白酶消化20h的分离效果优于消化16h和24h(P均<0.001)。5%FBS d K-SFM培养基原代培养宫颈上皮细胞增殖活性高于单纯d K-SFM培养基(P<0.05)。培养的原代正常宫颈细胞生长状况良好,细胞融合时呈典型铺路石样形态,可在体外传代至5代～6代,并可冻存与复苏,免疫细胞化学染色和免疫细胞荧光结果均显示95%以上细胞广谱角蛋白呈阳性表达。2.重组慢病毒EB-cop GFP(T2A)puro-E6感染原代正常宫颈细胞48h后,倒置荧光显微镜下观察可见感染组细胞胞浆内大量绿色荧光蛋白(cop GFP)表达;空的慢病毒EB-cop GFP(T2A)puro感染原代宫颈细胞也可见cop GFP表达阳性细胞;未感染细胞无荧光信号。普通倒置显微镜下,感染前后细胞形态相似,细胞数量无明显变化。3.q RT-PCR检测结果显示,HPV E6 mRNA在感染组、感染对照组和未感染组的相对表达量差异有统计学意义(χ2=7.2,P<0.05)。其中,HPV E6 mRNA在感染组的表达水平高于感染对照组及未感染组,差异均有统计学意义(P<0.017)。结论1.Ⅱ型中性蛋白酶消化20h联合胰酶法进行细胞分离,5%FBS d KSFM培养基可高效进行正常宫颈细胞原代和传代培养,并可以冻存与复苏;2.成功采用重组HPV E6基因慢病毒感染原代正常宫颈上皮细胞,为慢病毒介导其他外源基因对原代宫颈细胞的导入和宫颈癌发病机制的进一步研究奠定了基础。