糖尿病(DM, Diabetes Mellitus)是一种多病因的代谢性疾病,特点是慢性高血糖,伴随因胰岛素分泌及／或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。糖尿病包括两种类型1型即胰岛素依赖型(insulin-dependent-diabetes mellitus, IDDM)和2型即非胰岛素依赖型(non-insulin-dependent-diabetes mellitus, NIDDM)。目前糖尿病已经成为危害大众健康的主要疾病之一。糖尿病患者在世界范围内正在迅猛增加,预计到2030年糖尿病患者将达到3亿,糖尿病及其伴随的并发症日益受到人们重视,糖尿病可影响牙龈炎和牙周炎的发生发展：1型糖尿病儿童牙龈炎发生率显著高于非糖尿病患者,其牙龈发生炎症的位点是非糖尿病患者的两倍,有研究表明糖尿病患者牙周病发生率为75%。血糖水平影响牙周组织病变的严重程度,血糖控制不良患者牙周组织破坏更严重,且更容易出现不易愈合的牙周病损。牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性感染性疾病,主要表现为牙龈炎症、牙槽骨吸收、附着丧失、牙松动。是成人牙缺失的主要原因。牙周炎的病因除菌斑牙石等局部刺激因素外,还受到全身健康状况如妊娠不良、心血管疾病、糖尿病等的影响。由以糖尿病对牙周组织的影响倍受关注。糖尿病与牙周炎关系密切,二者均是多因素共同作用的疾病,糖尿病本身不引起牙周炎,但由于糖尿病产生的糖代谢紊乱、微血管病变,糖激化终末产物以及糖尿病对牙菌群、中性粒细胞功能、炎症反应强度及组织愈合能力的影响,均可导致牙周微循环障碍,促进牙周炎的发生发展。研究发现糖尿病人群中,牙周病的发病率高,病变损害严重且进展迅速。2型糖尿病患者牙周炎发病率是非糖尿病患者的3倍左右。动物模型研究表明糖尿病大鼠破骨细胞数量,活性远高于正常大鼠,糖尿病可引起持续更久的炎症反应,更多的附着丧失,更严重的牙槽骨吸收,使骨修复能力明显受损,防碍新骨形成。糖尿病与牙周炎呈双向关系,一方面血糖升高是牙周炎的危险因素,另一方面牙周炎做为局部疾病对全身组织或器官产生影响,牙周感染产生的炎症因子如TNF-α进入系统循环,可引起胰岛素抵抗。研究表明牙周的非手术治疗对糖尿病患者的血糖控制有一定的影响。糖尿病患者常伴随牙槽骨吸收,研究发现糖尿病大鼠牙槽骨骨吸收活跃,骨皮质变薄,其表面成骨细胞数目减少,很少见新骨形成,2型糖尿病患者发生牙槽骨吸收的危险性是非糖尿病患者的4倍。研究发现RANKL/OPG与牙周炎牙槽骨吸收有密切联系。核因子KB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kB ligand, RANKL)是肿瘤坏死因子配体超家族成员,来源于巨噬细胞,成纤维细胞,成骨细胞和T细胞。可结合于前体破骨细胞和破骨细胞表面,促进破骨细胞的分化成熟,诱发骨吸收。骨保护素(osteoprotegerin, OPG)是肿瘤坏死因子受体超家族成员,该蛋白与骨密度及骨含量有关,过度表达该蛋白的转基因小鼠骨质坚硬,敲除该基因的小鼠会发生严重的骨质疏松。OPG的主要作用是影响骨代谢,抑制破骨细胞的发生、分化、活化成熟及促进其凋亡。OPG是RANKL的天然抑制剂,可竞争性的抑制RANKL与核因子kB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB, RANK)的结合,从而抑制骨吸收。OPG/RANKL/RANK是破骨细胞活化的分子基础,RANKL与OPG的变化影响破骨细胞的形成和活化,从而影响骨吸收。糖尿病患者存在特异与非特异免疫功能异常,牙周炎的发生发展亦与免疫异常有关。而CD4,CD8是重要的免疫细胞,二者之间的平衡对于维持机体免疫应答起作用。本实验在没有外界刺激因素作用下,通过检测CD4,CD8在大鼠牙周组织的表达改变分析糖尿病状态下牙周组织免疫细胞功能的变化,通过检测RANKL,OPG在大鼠牙周组织中的改变情况,分析糖尿病对大鼠牙槽骨的影响。探讨糖尿病大鼠牙周组织病理改变的可能机制。目的1了解糖尿病状态下大鼠牙周组织的形态学改变；2了解糖尿病状态下大鼠牙周组织细胞免疫调节功能的改变；3通过了解牙周组织RANKL,OPG改变情况分析糖尿病大鼠牙槽骨吸收的可能风险。方法：1建立糖尿病大鼠模型SD大鼠随机分成两组：糖尿病组(DM n=30)和正常对照组(N n=8)。糖尿病大鼠高热量饲料喂养1个月后,建立肥胖模型,然后一次性静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ) (55mg/kg),建立糖尿病模型；对照组大鼠普通饲料喂养1个月后,一次性静脉注射0.1mol/L,pH4.5相同剂量的柠檬酸缓冲液；检测血糖、尿糖改变情况。糖尿病大鼠模型成功的标准为空腹状态下(禁食8小时)血糖值≥11.2mmol/L,尿糖为+++,24小时饮水量>50ml,体重下降且这些症状持续两周。2检查牙周情况于实验开始的第16周,3%戊巴比妥钠麻醉两组大鼠,观察两组大鼠牙龈的颜色、形状、质地、有无出血及牙龈退缩情况,用牙周探针探查大鼠牙周组织附着水平。3牙周组织形态学观察按实验分组,于实验开始的16周后在戊巴比妥钠麻醉下,行腹主动脉或内眦静脉放血处死大鼠,解剖上颌骨,4%多聚甲醛溶液固定24小时(4℃),EDTA(pH=7.4)液脱钙两周,洗涤,脱水,透明,浸蜡,石蜡包埋,制成3um厚连续切片,石蜡切片常规脱蜡,脱水,HE染色,光镜视野下观察,采集图像。4大鼠牙周组织CD4,CD8的免疫组织化学糖尿病组及正常组大鼠石蜡切片脱蜡,复水,3%过氧化氢液灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸盐缓冲液行热修复,10%山羊血清封闭,小鼠抗大鼠CD4,CD8单克隆抗体按1：100稀释,37℃恒温箱孵育1小时,加入FITC标记羊抗小鼠IgG(1：50稀释),37℃恒温箱孵育30分,激光扫描共聚焦显微镜采集图像,行灰度值分析。5大鼠牙周组织RANKL,OPG的免疫组织化学糖尿病组及正常组大鼠石蜡切片脱蜡,复水,3%过氧化氢液灭活内源性过氧化物酶,枸橼酸盐缓冲液行热修复,10%山羊血清封闭,兔抗大鼠RANKL,OPG单克隆抗体按1：100稀释,37℃恒温箱孵育1小时,加FITC标记羊抗兔IgG(1：50稀释),37℃恒温箱孵育30分钟,激光扫描共聚焦显微镜采集图像,行灰度值分析。6统计学处理应用SPSS17.0做统计分析处理,结果以X±s表示,方差齐性的样本采用独立样本t,方差不齐样本采用t’检验。p<0.05为差异有统计学意义。结果：1实验动物一般情况除糖尿病组2只大鼠死亡外,其余大鼠精神状态良好,活动自如,糖尿病组在注射STZ一周后尿糖增高,血糖值均高于11.2mmol/L,尿糖增高为+++,且出现多饮,体重下降,正常组血糖无明显变化。2牙周组织情况糖尿病组和对照组大鼠牙龈形状、质地没有明显异常,未发现牙龈萎缩,牙周探诊水平维持在初始水平,但糖尿病组大鼠牙龈颜色轻微发红,牙龈出血指数较对照组稍偏高3 HE染色观察糖尿病组大鼠牙周组织HE染色可见牙周膜纤维排列紊乱,破骨细胞形成。对照组大鼠胶原纤维排列整齐,未见破骨细胞。4牙周组织CD4,CD8荧光免疫组织染色结果糖尿病组CD4表达高于对照组(t=4.167 p=0.001),差异有统计学意义；糖尿病组CD8表达高于对照组(t=2.971 p=0.008),差异有统计学意义。5牙周组织RANKL,OPG荧光免疫组织染色结果糖尿病组RANKL表达高于对照组(t=-5.348 p=0.000),差异有统计学意义；与正常对照组相比,OPG表达降低,差异无统计学意义(t=-1.806 p=0.090)。结论：1糖尿病组大鼠HE染色出现破骨细胞,骨吸收陷窝及排列紊乱的胶原纤维,提示糖尿病虽然不能造成牙周组织实质性损害,但在一定程度上改变了牙周组织结构,影响其支持功能和防御功能,可能导致其抗感染能力下降。2糖尿病大鼠牙周组织CD4,CD8细胞表达水平高于对照组,提示糖尿病大鼠牙周组织细胞免疫功能可能出现变化,存在免疫调节功能和T细胞活化异常。3与正常对照组相比,糖尿病组大鼠RANKL表达升高,差异有统计学意义,OPG表达降低,差异无统计学意义,提示局部RANK和OPG之间出现平衡失调,破骨细胞形成增加,最终可导致牙槽骨吸收。