CXCR4基因沉默对膀胱癌细胞侵袭力及腔内种植影响的实验研究

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目的:构建靶向CXCR4的特异性siRNA真核表达载体,特异干扰RAN(siRNA)沉默EJ-M3细胞CXCR4因子,检测EJ-M3细胞CXCR4 mRNA的表达变化情况及CXCR4基因的表达蛋白情况;并观察特异性siRNA对EJ-M3细胞侵袭力的影响;裸鼠体内观察siRNA对EJ-M3膀胱腔内种植的能力的影响。方法:利用聚合酶体外合成以CXCR4为靶基因的siRNA,用脂质体2000转染膀胱癌细胞,G418筛选阳性克隆;有限稀释法获单克隆细胞;RT-PCR检测CXCR4 mRNA的表达变化情况,western blot检测蛋白表达水平;流式细胞仪测细胞周期,MTT法测细胞增殖;Boyden小室模型检测体外侵袭能力的变化;裸鼠动物模型试验检测对EJ-M3的腔内种植力的影响。结果:膀胱肿瘤细胞EJ-M3转染CXCR4siRNA后RT-PCR结果显示重组质粒pshRNA-CXCR4组CXCR4 mRNA的表达水平(0.149±0.03);空白对照组(0.44±0.08)和阴性对照组(0.43±0.05),(P<0.05);实验组与空白组对比:CXCR4的蛋白水平表达明显降低(38.45%±4.4%vs 97.21%±5.33,p<0.01);细胞的体外侵袭能力减弱(39..67±6.45 vs 87.33±8.38 p<0.01)。细胞周期的分布无明显差异;在无SDF-1存在的情况下,各组细胞的增殖无明显改变,经SDF-1刺激后,各组细胞增殖增加,但转染组细胞的增殖显著低于空白阴性组。(24 0.65±0.05 vs 0.71±0.03;P<0.05 48h 0.83±0.03 vs 0.94±0.04P<0.0572h 1.16±0.04 vs 1.53±0.07).裸鼠动物模型试验致瘤率实验组1例,空白对照组7例每组试验10只)经过T检验,P<0.05。结论:以CXCR4为靶向的siRNA能够有效下调基因;可以明显的抑制细胞EJ-M3CXCR4 mRNA的转录水平及CXCR4蛋白的表达;能降低SDF-1诱导的膀胱癌细胞系体外侵袭能力及增殖活性;同时也能降低膀胱癌的腔内种植能力。
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