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科研工作来源广西自然科学基金面上项目 NO 2016GXNSFAA380310研究目的和意义我们前期研究发现肢体缺血后处理对脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制可能与激活P38MAPK等通路有关。自噬是通过依赖溶酶体途径降解长半衰期蛋白及细胞器的一种细胞内自我分解代谢过程,是细胞生存、死亡的重要调节者。但肢体缺血后处理是否通过激活自噬对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用及其具体机制如何尚未明确。本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,并给予大鼠肢体缺血后处理,探讨肢体缺血后处理是否通过激活自噬途径发挥脑保护作用,同时进一步明确JNK和AMPK/mTOR信号通路是否是肢体缺血后处理激活自噬的上游通路,以期为肢体缺血后处理可能应用于临床实践提供理论依据。研究方法第一部分:自噬参与肢体缺血后处理对脑缺血再灌注损伤的作用:实验大鼠随机分成假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、缺血再灌注+肢体缺血后处理组(LpostC组)、缺血再灌注+肢体缺血后处理+自噬激动剂雷帕霉素组(Rapa组)和缺血再灌注+肢体缺血后处理+自噬抑制剂3-MA组(3-MA组)。通过HE和TTC染色法观察病理形态学变化和脑梗死体积;免疫组化和WB检测LC3Ⅱ、Beclin 1和Cathepsin B的蛋白表达和蛋白水平。第二部分:JNK信号通路依赖的自噬参与肢体缺血后处理的作用机制:实验大鼠随机分成Sham组、I/R组、LPostC组、缺血再灌注+肢体缺血后处理+JNK抑制剂sp600125组(sp6组)。WB检测Beclin 1、LC3Ⅱ和p-JNK的蛋白水平。第三部分:AMPK/mTOR依赖的自噬参与肢体缺血后处理的作用机制:实验大鼠随机分成Sham组、I/R组、LPostC组、缺血再灌注+肢体缺血后处理+AMPK 抑制剂 compound C 组(compound C 组)。WB 检测 Beclin 1、LC3Ⅱ、p-AMPK和p-mTOR的蛋白水平。研究结果第一部分:1、HE染色结果:I/R组神经元排列紊乱,许多神经元核固缩深染,呈空泡状改变。LPostC组病理学改变较I/R组轻。Rapa组病理学改变更轻,3-MA病理学改变重。2、TTC染色结果:与I/R组相比,LPostC组梗死体积小(P<0.05);与LPostC组相比,Rapa组梗死体积更小(P<0.05),而3-MA组梗死体积大(P<0.05)。3、免疫组化Beclin 1和Cathepsin B蛋白表达结果:与Sham组相比,I/R组两者的蛋白表达均增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白表达均增高(P<0.05);与LPostC组相比,Rapa组蛋白表达进一步增高,3-MA组均降低(P<0.05)。4、WB检测Beclin 1、LC3Ⅱ和Cathepsin B蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组三者的蛋白水平均增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平均增高(P<0.05);与LPostC组相比,Rapa组蛋白水平均进一步增高,3-MA组均降低(P<0.05)。第二部分:1、Beclin 1和LC3Ⅱ的蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组两者的蛋白水平增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平更高(P<0.05);与LPostC组相比,sp6组蛋白水平降低(P<0.05)。2、p-JNK的蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组蛋白水平增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平更高(P<0.05);与LPostC组相比较,sp6组蛋白水平降低(P<0.05)。第三部分:1、Beclin 1和LC3Ⅱ的蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组两者的蛋白水平增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平更高(P<0.05);与LPostC组相比,compound C组蛋白水平降低(P<0.05)。2、p-AMPK的蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组蛋白水平增高(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平更高(P<0.05);与LPostC组相比,compound C组蛋白水平降低(P<0.05)。3、p-mTOR的蛋白水平结果:与Sham组相比,I/R组蛋白水平降低(P<0.05);与I/R组相比,LPostC组蛋白水平更低(P<0.05);与LPostC组相比,compound C组蛋白水平升高(P<0.05)。研究结论1.肢体缺血后处理通过激活自噬在脑缺血再灌注损伤中发挥保护作用。2.JNK信号通路是脑缺血再灌注时肢体缺血后处理激活自噬的可能途径之一。3.AMPK/mTOR信号通路是脑缺血再灌注时肢体缺血后处理激活自噬的可能途径之一。