目的NLRP3(NOD-LRRS containing pyrin domain3)是NLR(NOD-like receptor)家族成员之一,NLRP3炎症小体在caspase-1的活化和IL-1p的成熟分泌过程中起重要的作用。目前NLRP3的研究多侧重于炎症小体的活化机制,而NLRP3表达调控机制尚不清楚。本课题研究目的在于阐明NLRP3表达调控的分子机制。本课题研究发现在小鼠巨噬细胞内TLR配体能够上调NLRP3mRNA和蛋白的表达,并且这一上调作用依赖于NF-κB的活化。通过构建一系列NLRP3启动子区不同长度的截短突变体荧光报告基因载体,并对其荧光报告基因活性分析,我们在NLRP3启动子区找到两个NF-κB的结合位点(nt-1303to-1292和nt-1238to-1228),并且用ChIP和EMSA的方法进一步验证NF-κB和NLRP3启动子的直接结合作用。本课题阐明了NF-κB和NLRP3启动子区nt-1303to-1292和nt-1238to-1228这两个位点特异性结合,从而上调NLRP3的表达的分子机制。方法1.检测TLR配体诱导的小鼠巨噬细胞内NLRP3表达情况1.1LPS/PGN刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞,RT-PCR和Western blot检测NLRP3mRNA和蛋白的表达1.2LPS/PGN刺激RAW264.7细胞系,RT-PCR和Western blot检测NLRP3mRNA和蛋白的表达2.检测NF-KB抑制剂(JSH-23)预处理小鼠巨噬细胞,TLR配体诱导的NLRP3表达情况2.1NF-κB特异性抑制剂(JSH-23)预处理小鼠原代腹腔巨噬细胞,RT-PCR和Western blot检测LPS/PGN诱导的NLRP3mRNA和蛋白的表达2.2NF-κB特异性抑制剂(JSH-23)预处理RAW2647细胞系,RT-PCR和Western blot检测LPS/PGN诱导的NLRP3mRNA和蛋白的表达3.双荧光报告基因分析LPS诱导的NLRP3启动子活化情况3.1一系列小鼠NLRP3基因启动子的克隆以及相应报告基因重组质粒的构建利用TRANSFAC6.0数据库对NCBI基因数据库中小鼠NLRP3基因(NT-096135)5’上游3500bp序列进行分析,设计合适的上下游引物,以RAW264.7细胞系基因组DNA为模板,PCR扩增一系列NLRP3启动子区DNA片段(nt-3033to+166,-2032to+166,-1733to+166,-1434to+166,-1113to+166,-824to+166),引入限制性酶切位点KpnI、XhoI,将PCR产物双酶切克隆入报告基因质粒pGL3-basic,构建6个重组报告基因质粒,并进行双酶切和测序验证。结合基因组数据库中信息及前期结果,选取小鼠NLRP3启动子nt-2032to-1434和nt-1434to-1113两个片段,设计合适引物构建报告基因质粒,构建方法同上,菌液PCR验证重组载体是否构建成功。3.2报告基因质粒转染RAW264.7细胞系及双荧光素酶活性分析将构建的8个重组报告基因质粒和不含启动子和增强子的阴性对照pGL3-basic分别与内参质粒pRL-TK同时瞬时转染RAW264.7细胞系,24h后加LPS或者PGN刺激8h,然后裂解细胞并收集裂解液,用Promega双荧光报告基因分析仪对其进行双荧光素酶活性分析,每组实验至少重复三次,每次设置3-4个复孔。3.3报告基因质粒转染HEK293细胞系及双荧光素酶活性分析将构建的8个重组报告基因质粒和不含启动子和增强子的阴性对照pGL3-basic分别与内参质粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88质粒或者pCMV-N-vector同时瞬时转染HEK293细胞系,24h后裂解细胞并收集裂解液,用Promega双荧光报告基因分析仪对其进行双荧光素酶活性分析,每组实验至少重复三次,每次设置3-4个复孔。4NLRP3启动子区NF-KB结合位点的识别4.1构建NLRP3启动子区预测NF--κB结合位点定点突变报告基因质粒根据前期结果以及TRANSFAC6.0数据库分析,在nt-1434to-1113区间内预测到nt-1303to-1292(A)(AGGGAACCCCCG)和nt-1238to-1228(B)(GGAAAATCCAT)两个可能的NF-kB结合位点,利用定点突变试剂盒(TOYOBO KOD-Plus-Mutagenesis Kit),以NLRP3(-1434/-1113)报告基因质粒为模板对A、B两个位点进行定点单突变和双突变,构建NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、NLRP3(-1434/-1113)MutAB三个重组报告基因质粒,构建和验证方法同3.2。4.2突变体报告基因质粒转染RAW264.7细胞系及双荧光报告基因分析转染和双荧光报告基因分析方法同3.24.2突变体报告基因质粒转染HEK293细胞系及双荧光报告基因分析转染和双荧光报告基因分析方法同3.3。5体内和体外实验分析NF-KB与NLRP3启动子区的结合情况5.1凝胶迁移实验(EMSA)体外分析NF--κB亚基p65与NLRP3启动子区结合情况合成NLRP3启动子区nt-1313to-1284段寡核苷酸序列(包含预测NF-κB结合位点A),生物素标记,之后进行EMSA分析。5.2染色质免疫共沉淀实验(ChIP)体内分析NF-κB亚基p65与NLRP3启动子区结合情况LPS刺激原代腹腔巨噬细胞1h,用CHIP试剂盒(Upstate Biotechnology,NY)对巨噬细胞染色质进行固定、沉淀、纯化,设计包含NLRP3nt-1348to-1183片段的引物,以纯化的DNA为模板,进行PCR扩增,之后琼脂糖凝胶电泳检测。结果1TLR配体上调小鼠巨噬细胞中NLRP3表达无论是在mRNA还是蛋白水平,无论是在小鼠原代腹腔巨噬细胞中还是在RAW264.7细胞系中,LPS/PGN均能刺激NLRP3的表达上调,且呈一定的时间依赖性。2TLR诱导的NLRP3表达依赖于NF-KB活化2.1小鼠原代腹腔巨噬细胞中,在mRNA和蛋白水平上,分别检测到JSH-23预处理组LPS/PGN诱导的NLRP3表达水平明显比DMSO对照组低。2.2RAW264.7细胞系中得到与2.1相似的结果,而且JSH-23预处理组LPS/PGN诱导的NLRP3表达消失。以上两个结果说明LPS/PGN等TLR配体诱导的NLRP3表达与NF--κB活化有关,当NF-κB通路被阻断之后TLR配体诱导的NLRP3表达被减弱甚至被阻断。3双荧光报告基因分析明确NF-KB与NLRP3启动子区的结合靶位点3.1小鼠NLRP3启动子区一系列截短突变体报告基因质粒的构建及测序验证成功构建小鼠NLRP3启动子区一系列截短突变体报告基因质粒,经双酶切及测序验证插入的片段序列和方向正确无误,分别命名为NLRP3(-3033)、 NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)、NLRP3(一1113)、NLRP3(-834)、NLRP3(-2032/-1434).NLRP3(-1434/-1113).3.2报告基因质粒转染RAW264.7细胞系及双荧光素酶活性分析将上述质粒分别与pRL-TK质粒共转染进RAW264.7细胞系中,转染24h后LPS或者PGN刺激8h,收集细胞裂解液做双荧光素酶报告基因活性分析。报告基因活性分析显示：LPS刺激组的NLRP3(-3033)双荧光素酶活性约是不刺激组的4倍,这说明在NLRP3启动子区nt-3033to+166之间包含LPS上调NLRP3表达的顺式作用元件。其他截短突变体双荧光报告基因分析结果显示,NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)报告基因活性LPS刺激组分别是其对应不刺激组的5倍、4倍、3倍,而NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)报告基因活性在LPS刺激组和不刺激组之间无明显差异。PGN刺激之后报告基因活性检测得到相似的结果,这些结果暗示：LPS/PGN上调NLRP3表达的顺式作用元件可能位于NLRP3启动子区nt-1434to-1113之间,即LPS/PGN刺激RAW264.7细胞,引起的NF-κB入核可能结合于NLRP3启动子区nt-1434to-1113之间的某段DNA序列,从而调控NLRP3的表达。LPS刺激组的NLRP3(-1434/-1113)报告基因活性是不刺激组的20倍,LPS刺激之后NLRP3nt-1434to-1113这一区段和不刺激组之间,报告基因活性无显著差异,这一结果进一步证明了上述结论。3.3报告基因质粒转染HEK293细胞系及双荧光素酶活性分析将构建的8个重组报告基因质粒和不含启动子和增强子的阴性对照pGL3-basic分别与内参质粒pRL-TK以及pCMV-N-MyD88质粒或者pCMV-N-yector同时瞬时转染HEK293细胞系,24h后检测报告基因活性,MyD88转染组中NLRP3(-2032)、NLRP3(-1733)、NLRP3(-1434)报告基因活性分别是其对照组的2倍、1.5倍、1.5倍,而NLRP3(-1113)、NLRP3(-834)报告基因活性在MyD88转染组和对照组均未活化。这更进一步说明了NLRP3启动子的活化依赖NF--κB的活化,而且NF--κB入核可能结合于NLRP3启动子区nt-1434to-1113之间的某段DNA序列,从而调控NLRP3的表达。4NLRP3启动子区NF-KB结合位点的识别4.1成功构建了NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB、 NLRP3(-1434/-1113)MutAB三个定点突变体重组报告基因质粒4.2定点突变体报告基因质粒转染RAW264.7细胞系及双荧光素酶报告基因活性分析将上述定点突变质粒分别与pRL-TK质粒共转染进RAW264.7细胞系中,转染24h后LPS刺激8h,收集细胞裂解液做双荧光素酶报告基因活性分析。报告基因活性分析显示：LPS可以明显的增强NLRP3(-1434/-1113)报告基因活性,而且当两个预测的NF-κB结合位点A、B分别被突变掉之后,LPS仍然能够增强NLRP3(-1434/-1113)MutA、NLRP3(-1434/-1113)MutB两个报告基因活性,但是当两个预测的NF-κB结合位点A、B同时被突变之后,LPS这一增强作用被减弱,这说明NLRP3启动子区nt-1434to-1113之间的A、B两个位点有可能是LPS刺激引起的NLRP3表达上调的顺式作用元件所在的位置,且两个起协同作用。4.3定点突变体报告基因质粒转染HEK293细胞系及双荧光素酶报告基因活性分析无论是A、B两位点的单突变体还是双突变体,突变后MyD88转染组其报告基因活性未被活化,也就是说A、B两位点突变之后,NF--κB对NLRP3启动子的活化作用消失了,这更进一步验证了上述结论。5体内和体外实验验证NF-KB与NLRP3启动子区结合5.1EMSA体外验证NF--κB与NLRP3启动子区结合选取NLRP3启动子区nt-1313to-1284(A)合成DNA双链并进行生物素标记以及EMSA分析,分析结果显示LPS刺激的腹腔原代巨噬细胞核蛋白能够在体外跟探针A结合,而且加入P65抗体组出现滞后带,说明是核蛋白中的NF-κB与探针A特异性结合,这一结果证实了NLRP3启动子区nt-1313to-1284(A)在体外与P65的结合作用5.2ChIP体内验证NF-KκB与NLRP3启动子区结合以纯化之后的DNA片段为模板PCR, LPS未刺激情况下,在anti-actin对照组和anti-p65实验组均无目的带；而在LPS刺激情况下,在anti-p65实验组出现明显的特异性的条带,这一结果体内验证NF-κB与NLRP3启动子区nt-1348to-1183片段直接结合。结论1本课题研究发现在小鼠巨噬细胞内TLR配体能够上调NLRP3mRNA和蛋白的表达,并且这一上调作用依赖于NF-κB的活化。2成功构建一系列NLRP3启动子区不同长度的截短突变体及定点突变体荧光报告基因载体,并对其荧光报告基因活性分析,我们在NLRP3启动子区找到两个NF-κB的结合位点(nt-1303to-1292和nt-1238to-1228),这可能是LPS等TLR配体上调NLRP3表达的顺式作用元件位置。3ChIP和EMSA的方法进一步验证NF--κB和NLRP3启动子区的直接结合作用。本课题阐明了NF--κB与NLRP3启动子区nt-1303to-1292(A)和nt-1238to-1228(B)这两个位点特异性结合,从而上调NLRP3的表达的这一分子机制。创新性和意义NLRP3炎症小体作为固有免疫的重要组成部分,在机体免疫反应和疾病发生过程中具有重要作用。炎症小体的研究成为世界范围内的一个研究热点,NLRP3作为炎症小体重要的组成部分,其表达调控分子机制目前尚不清楚。文献报道,TLR信号通路活化能够诱导人单核细胞中NLRP3表达,与此相一致,我们在小鼠巨噬细胞中也发现TLR(?)(?)体LPS/PGN能够诱导NLRP3的表达,因此我们为研究NLRP3表达调控建立了一个相对稳定的体系。TLR和NLR是两种最重要的模式识别受体,最近的研究表明,TLR和NLR两条信号通路之间的交互作用对固有免疫调节起到至关重要的作用。我们的研究证实了TLR配体可以上调NLRP3的表达,这提供了TLR和NLR两条信号通路之间存在交互作用的一个实例。本课题运用基因工程技术成功构建了一系列NLRP3启动子区的报告基因质粒,分析LPS/PGN等对NLRP3活化的影响,确定了TLR配体激活的NF--κB信号通路作用于NLRP3启动子区的nt-1303to-1292和nt-1238to-1228这两个靶位点,并运用EMSA和CHIP进一步验证。本课题阐明了炎症相关因子NLRP3的表达调控机制,填补了这一研究领域的空白,为炎症相关疾病的治疗提供了可能的理论支持。