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目的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)中的神经元表现出其神经元活动的昼夜变化。并且我们也发现对SCN进行输入的神经突触也会表现出以一天为周期的节律性变化。光的有无是影响生物体昼夜节律最大的因素,并且谷氨酸是视网膜-下丘脑通路(retino-hypothalamic tract,RHT)上突触末梢分泌的主要的神经递质。在各类型神经元突触中,我们发现谷氨酸能和GABA能突触两者的微型突触后电流(miniature postsynaptic currents,mPSC)在频率上的日常变化。其中,血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)神经元作为在SCN脑区内对昼夜节律有重要作用的神经元,是可以直接接受RHT末梢表达的谷氨酸能信息的输入。因此,我们想探讨VIP神经元对于SCN内神经元活动的昼夜变化性质是如何起到作用。方法1.小鼠脑片制备使用2-3个月大的C57/B6与VIP-ires-Cre::Rosa-GCaMP5转基因小鼠用4%异氟烷麻醉后,快速完整地取出整脑(小鼠处于黑暗情况下则在昏暗红光下进行)。在NMDG切片液中切除300μm/片的冠状面脑片,将含有SCN脑区的脑片在装有细胞外液的脑片收集槽中以37℃水浴锅中孵育45分钟,并伴随95%氧气+5%二氧化碳的混合气不断向细胞外液中充氧。2.全细胞膜片钳记录在室温下对SCN脑区内GABA能和谷氨酸能突触的mPSC进行电生理记录(使用不同的水浴溶液);转基因鼠脑片使用波长470 nm蓝光激发,可以在荧光显微镜下看到SCN内VIP神经元。3.统计学方法为了检测突触的微电流活动,记录用高斯滤波器在Clampfit 10.7中以1 kHz进行低通滤波进行分析。用人体视觉检查来评估检测的质量,如果假阳性和假阴性事件的总数超过检测事件数量的10%,则整个过程将重复使用新的方法分析。测量每个检测到的突触活动的峰值幅度作为来自基线的峰值的局部最小值。通过将活动数除以总时间来计算微型活动的频率。数据以平均值±SEM表示。文中指出的n个值是记录的细胞数量。mPSCs的平均频率是来自每个细胞的微型事件频率的平均值。平均mPSC幅度是每个细胞的平均峰值幅度的平均值。p<0.05具有统计学意义。结果1.谷氨酸能mPSCs在黑暗期(0.57±0.12 Hz,n=27)明显高于光亮期(0.24±0.05Hz,n=24),但是它们的峰值振幅在光(7.29±0.47pA,n=24)和暗相(6.93±0.51pA,n=27)之间没有显着差异;2.与光相(3.56±0.98Hz,n=13)相比,黑暗阶段(1.14±0.14Hz,n=29)中GABA能mPSC的频率显着降低。与光相(3.56±0.98 Hz,n=13)相比,黑暗阶段(1.14±0.14 Hz,n=29)GABA能mPSCs的频率显着降低,但是在光42.43±6.38 pA,n=13)和暗相(35.10±3.34 pA,n=29)其峰值幅度并没有统计学差异;3.小鼠在适应jetleg(time shift 4 h),在适应新光暗环境的第三天检测小鼠SCN内神经元GABA能(Daytime:0.24±0.05Hz,n=24;Daytime(Dark):0.11±0.02Hz,n=13)和谷氨酸能(Daytime:3.56±0.98Hz,n=13;Daytime(Dark):2.85±0.58Hz,n=12)mPSC各自的频率变化均没有统计学差异;4.在由暗相进入光相的适应阶段,谷氨酸能(Night:0.40±0.14Hz,n=15;Night(Light):0.18±0.03Hz,n=15)mPSC量子释放降低,GABA能(Night:1.46±0.27Hz,n=15;Night(Light):2.12±0.38Hz,n=14)mPSC量子释放升高;5.转基因VIP-cre:GCaMP5小鼠用于鉴定VIP神经元,并且对VIP神经元和非-VIP进行记录。在LD周期中,VIP神经元与黑暗阶段相比,在光照阶段中谷氨酸能mPSC的频率较高,GABA能mPSCs的频率较低(谷氨酸能mPSC:0.42±0.14Hz,n=14[L]与0.85±0.28pA,n=11[D];GABA能mPSC:1.01±0.20Hz,n=11[L]对0.50±0.10Hz,n=11[D])。L和D分别是Light和Dark的简写。结论验证了外界光暗环境是影响SCN神经元活动的重要因素,量子事件的可塑性可能影响SCN神经元在日常周期中的输出,并且我们推测VIP神经元电活动的昼夜差异介导了SCN神经元昼夜电活动的差异。目的在神经环路研究中,确定目标神经元的上游的有效方法就是逆向追踪。病毒载体是对神经系统强大的基因递送载体,但是大部分现在可用的工具逆行转运效率不高以及有限的临床潜力。因此,我们应用了新进化的变种r AAV2-retro对视交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)进行有效的逆向追踪,其效率可与传统的合成逆行追踪剂相媲美,并且能够在靶向神经元群体中进行功能性回路询问和体内基因组编辑的足够的传感器/效应器表达。我们在此对SCN上游进行观察和统计。方法1.病毒注射健康成年Ai9转基因小鼠按照体重注射1%戊巴比妥钠使其麻醉。麻醉后,将小鼠固定在适配器上。然后剪开头皮,充分暴露小鼠前囱(bregma)点和人(lambda)字点。然后重新固定小鼠头颅使bregma点和lambda点处于同一水平,根据图谱标记好颅骨上的位置并打孔。将微量注射器倾斜10°按照给定的坐标注射。2.冰冻脑切片注射病毒三周后,对小鼠用4%多聚甲醛心脏灌流,取出全脑,在4%多聚甲醛后固定约20小时,用30%蔗糖溶液脱水沉糖,脱水完成后,用冰冻切片机以50μm/片切取冠状面脑片,玻片贴片后,用PBS清洗三遍,盖上盖玻片,封片。3.病毒观察与拍片在荧光显微镜下观察每张脑片的荧光表达情况,对照小鼠脑图谱做好记录。然后用共聚焦显微镜拍片。结果与结论我们观察到的SCN的上游确定的核团有:腹外侧视前核,前皮质杏仁核,前背侧内侧杏仁核,下丘脑腹内侧核,膝状体间小叶,缰核,后部丘脑室旁核,不确定区域,后部下丘脑弓状核+后内侧部分下丘脑弓状核,后内侧皮质杏仁核,前外侧部分海马区杏仁核+后腹部内侧杏仁核,后部基底中部杏仁核+后部基底侧核杏仁核,外嗅皮层+颞叶联合皮层,背侧乳头体核,下丘脑后区,埃-韦二氏核。