研究背景恙虫病(Scrub typhus, tsutsugamushi disease),又称丛林斑疹伤寒,是一种自然疫源性疾病, 由感染了恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi, O. tsutsugamushi)的恙螨幼虫叮咬而传播给人,以鼠类为主要宿主。该病的临床表现以特征性焦痂或溃疡、高热、淋巴结肿大、皮疹为主要特征,并可引起多种并发症甚至死亡。恙虫病广泛流行于亚洲太平洋沿岸地区,每年发病人数达100万例,因误诊或未及时治疗的患者病死率可高达15%。目前,我国至少29个省(直辖市或自治区),1031个县区存在恙虫病的感染与流行。作为重点疫区之一的山东,其疫情已波及全省80%的地区,且新的疫区不断出现、流行强度逐年增局。恙虫病的流行特征、临床严重程度与感染O. tsutsugamushi的型别有关,而不同国家／地区O. tsutsugamushi基因型的分布存在地域差异。单价疫苗对异型菌株攻击的免疫保护性差,针对不同地区研制含不同类型保护性抗原／基因的多价疫苗是恙虫病疫苗发展的方向。因此,掌握恙虫病流行区的O. tsutsugamushi基因型及分布对于该地区恙虫病的免疫预防及诊断治疗具有重要意义。研究目的1.通过对山东恙虫病主要流行区的病人及宿主动物O.tsutsugamushi感染的调查及实验室分析,探讨O. tsutsugamushi的基因型及其宿主、地区分布特征,阐明该地O. tsutsugamushi流行株及优势株。2.对筛选出的基因变异株STA-07的分子结构进行分析,比较其与国际参考株(Gilliam、Karp、Kato、Kawasaki、Kuroki、Boryong和Shimokoshi)及山东优势株的核苷酸及氨基酸序列的差异,为恙虫病的预防控制提供理论参考。研究方法根据山东省疾病报告信息系统的恙虫病疫情资料及以往研究基础,选取山东省泰安市的岱岳区、新泰市,临沂市的蒙阴县,淄博市的沂源县,青岛市的即墨市、黄岛区,莱芜市的莱城区和枣庄市的市中区、台儿庄区、峄城区为现场调查点,于2013年6月至2015年12月在上述10个调查点分室内室外采用笼夜法进行捕鼠并采集鼠内脏组织。对调查点辖区内各监测医院或卫生室上报的恙虫病病例或疑似病例采集急性期全血及焦痂标本,并收集有关临床及流行病学资料。对采集的血液、焦痂和鼠标本提取基因组DNA,以巢式PCR针对O. tsutsugamushi 56-kDa TSA基因进行扩增以检测标本中的O.tsutsugamushi DNA。对PCR目的基因的扩增产物进行纯化、回收并测序。将本研究所得序列、自NCBI GenBank获得的国际参考株和山东地区以往研究的代表株建立数据库,以Mega5.0软件包进行序列分析：以Blast进行同源性检索,Clustal W程序进行序列排序,采用邻接法(neighbor-joining)绘制系统发育树, bootstrap分析重复数设定为1000。将比对后的序列导入Lasergene软件MegAlign,采用Sequence distance计算序列同源性。根据捕获的宿主动物及O.tsutsugamushi DNA检测结果,计算宿主动物种属构成及感染状况,绘制各型的地区分布图。对筛选的基因变异株STA-07的O.tsutsugamushi 56-kDa TSA的核苷酸及氨基酸进行组分分析,基因编码产物采用SOPMA分析其二级结构、TMHMM预测跨膜区、SiganlP预测信号肽和Protean预测其抗原表位。用Mega5.0及MegAlign分析比较STA-07基因型56-kDa TSA的各可变区核苷酸及氨基酸序列与参考株的差异。结果1.标本收集及感染状况在10个调查点于四个季度中共捕获2360只鼠,包括褐家鼠(1784只,75.59%)、小家鼠(306只,12.97%)、黑线姬鼠(225只,9.53%)、大仓鼠(25只,1.06%),小仓鼠(8只,0.34%)和鼩鼱(12只,0.51%)。山东地区宿主动物中O. tsutsugamushi的检出率为0.76%(18/2360),其中褐家鼠、小家鼠、黑线姬鼠及大仓鼠中均存在O. tsutsugamushi的自然感染,携带率分别为0.45%、1.63%、1.78%和4.00%。春、夏、秋、冬四季宿主动物中O. tsutsugamushi携带率分别为0%、0.17%、1.17%和0.97%。在病例、疑似病例中共收集352份急性期抗凝血样和6份焦痂标本,巢式PCR检测出115份阳性标本,其中焦痂标本均为阳性。2.进化分析和同源性分析检测所得O.tsutsugamushi基因型包括类Kawasaki和STA-07型两种。类Kawasaki为优势基因型(93.9%,124/132),各序列相互之间的同源性较高(99.3%-100%)。STA-07型包含3条来自病例的血液与焦痂标本、5条来自宿主动物的组织标本。8条序列相互之间的同源性为99.5%-100%,与各参考株的同源性为64.2%-76.1%。3. O. tsutsugamushi基因型的地区分布本研究中O. tsutsugamushi优势基因型类Kawasaki在淄博、临沂、泰安、青岛、枣庄及莱芜的标本中均有检测到,STA-07型分布于淄博、临沂、枣庄、泰安、青岛。结合山东地区以往研究表明,类Kawasaki和STA-07分布范围广,类Karp、类Shimokoshi、类Fuji仅在临沂和泰安地区检测到。4.STA-07型56-kDa TSA分子结构及分析应用SeqMan拼接所得长为1562bp的基因片段,包括5’端长为245bp的非编码区序列和长度为1317bp编码区序列。非编码区含有两个串联启动子及核糖体结合位点。编码区A+T=58.47%,编码的氨基酸长度为439aa,其中使用频率较高的有Ala (10.93％)、Leu (8.66％)、Val (7.29％)和G1n(7.06%),较少的为Trp(0.46%)和Cys (0.58％)。SOPMA预测基因编码产物二级结构中的a-螺旋占36.67%,β-转角占9.79%,无规则卷曲占37.36%,延伸占16.17%。跨膜区预测结果提示STA-07基因编码产物1-439aa均为膜外区。SignalP信号肽预测结果提示在1-22aa存在信号肽,预测的信号肽酶裂解位点在Ala-22和Ile-23之间。Protean综合亲水性、柔韧性、抗原指数及表面可能性发现在基因编码产物的57-65、122-135、153-169、191-199、219-230、251-258和339-353处各指数较高,提示可能为抗原表位。5.STA-07型56-kDa TSA可变区分子特征分析STA-07及主要参考株(Gilliam、Karp、Kato、Shimokoshi、Kuroki、Boryong、 Kawasaki和类Kawasaki)的O.tsutsugamushi 56-kDa TSA氨基酸序列均存在一个或多个氨基酸残基的缺失或替补,差别主要位于四个可变区VD I-VD IV。STA-07的序列进化结果显示,各个区的核苷酸及氨基酸均处于单独的分支上。亲水性模型显示编码区由疏水段与亲水段交替组成,可变区主要处于亲水段。(1)在Ⅰ区,STA-07与类Kawasaki的氨基酸同源性最高,为87.5%(核苷酸同源性为80.0%),差异体现为STA-07在第22和23位置上的氨基酸缺失以及35位上的T(Thr)替换为A (Ala).与Gilliam、Karp、Kato、Shimokoshi、Kuroki、 Boryong和Kawasaki氨基酸同源性均低于60.0%。Karp中抗原肽的序列(33-39位氨基酸)A-D-S-V-G-G-K-D在STA-07中替换为A-N-T-T-V-D-T-D。(2)在Ⅱ区,STA-07与Gilliam、Karp、Kato、Kawasaki、Shimokoshi、Kuroki、 Boryong和类Kawasaki型的氨基酸相似性均低于50.0%。核苷酸序列相似性为42.9%-60.7%。相对于山东优势株类Kawasaki而言,STA-07在此区缺失的氨基酸较少但变异较大,D-I-L-A-Q-A-A替换为G-N-M-T-R-A-E,84-88位的Q-L-T-V-E替换为D-D-D-V-I。(3)在Ⅲ区,STA-07与Kuroki及Boryong的氨基酸序列同源性较高,均为67.6%(核苷酸相似性为71.2%),与Karp的氨基酸相似性为64.7%(核苷酸相似性为68.5%),而与Gilliam、Kato、Kawasaki、Shimokoshi和类Kawasaki的氨基酸相似性均低于50.0%(核苷酸相似性低于60.0%)。(4)在Ⅳ区,STA-07与Kuroki及Boryong的氨基酸相似性较高,均为74.3%(核苷酸相似性为67.8%),与Gilliam及Karp的相似性均为71.4%,而与Kato、 Kawasaki、Shimokoshi和类Kawasaki的氨基酸相似性均低于60.0%。结论1.山东恙虫病主要疫区的O.tsutsugamushi贮存宿主包括褐家鼠、大仓鼠、黑线姬鼠和小家鼠,宿主动物的携带率为0.76%,其中大仓鼠为O.tsutsugamushi贮存的优势宿主。2.本研究结果结合山东以往研究表明,O. tsutsugamushi优势基因型类Kawasaki分布于泰安、临沂、淄博、青岛、莱芜和枣庄,STA-07分布于泰安、临沂、淄博、青岛和枣庄,类Karp仅在临沂地区检测到,类Shimokoshi和类Fuji仅在泰安地区检测到。其中感染3种及以上O.tsutsugamushi型别的地区包括泰安和临沂。3.STA-07型1-22aa存在信号肽,预测信号肽酶裂位点在Ala-22和Ile-23之间。扩增的56-kDa TSA基因编码产物均为膜外区。4.STA-07型O.tsutsugamushi 56-kDa TSA基因编码产物的57-65、122-135、153-169、191-199、219-230、251-258和339-353aa处可能存在抗原表位。5.STA-07型O.tsutsugamushi 56-kDa TSA可变区的变异较大,四个可变区的核苷酸及氨基酸序列均处于单独分支上,其中VD Ⅱ表现出较高的型特异性。