近年来,随着人们对食品安全及生态环境的关注度不断提高,抗生素残留和细菌耐药性等问题也逐渐暴露出来,抗生素的禁用将会是畜牧兽医行业发展的必然趋势。因此,寻求开发绿色、安全的替代抗生素的饲料添加剂刻不容缓。姜黄素(Curcumin,Cur)是从中药姜黄中提取的一种酚类物质,作为一种多效的天然活性成分,姜黄素有希望取代抗生素,在畜禽“无抗养殖”中发挥重要作用。虽然长期以来姜黄素作为一种常用的天然色素,已被广泛地应用在食品工业中,但其在畜牧兽医生产中的应用性研究相对较少,尤其是在减少畜禽脂肪沉积效果方面的研究更少。本研究以原代培养的猪前体脂肪细胞和小鼠3T3-L1前体脂肪细胞系为体外模型,探讨姜黄素对脂肪细胞增殖和成脂分化的影响,并以高脂日粮诱导的C57BL/6J肥胖小鼠为体内模型,深入探讨姜黄素对小鼠脂肪沉积的调控作用及对高脂饮食诱导小鼠肥胖的抑制效果。研究结果将为姜黄素作为安全、有效的饲料添加剂在畜牧兽医生产上的应用提供科学依据。实验一、姜黄素对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖和成脂分化的作用研究将小鼠3T3-L1前体脂肪细胞进行增殖培养,待细胞达到80%-90%融合时,利用含终浓度为 0.1 mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),2.5 μμmol/L地塞米松(DEX),1 μg/mL胰岛素(Insulin)和2 μmol/L罗格列酮的诱导分化液I对细胞进行诱导分化,同时添加不同浓度姜黄素处理,共分为6组:①未诱导分化组(None,完全培养基);②诱导分化对照组(DM,诱导分化液+姜黄素溶解试剂DMSO);③诱导分化液+2.5 μμmol/L姜黄素组(DM+2.5μmol/LCur);④诱导分化液+5μmol/L 姜黄素组(DM+5μmol/LCur);⑤诱导分化液+10 μmol/L姜黄素组(DM+10 μmol/L Cur);⑥诱导分化液+15 μmol/L姜黄素组(DM+15 μmol/L Cur);3天后,更换只含有1 μg/mL Insulin的诱导分化液II进行处理,2天换液一次,6天后(共处理9天)在显微镜下观察细胞成脂分化情况,采用CCK法检测细胞增殖活力,通过油红O染色和甘油三酯(TG)定量试剂盒检测细胞内TG含量,通过甘油含量测定试剂盒和小鼠游离脂肪酸(FFA)ELISA检测试剂盒测定细胞上清中甘油和FFA的含量,通过以上指标综合评价姜黄素对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖和成脂分化的影响。此外,通过荧光定量PCR(q-PCR)法进一步检测姜黄素对3T3-L1细胞成脂分化相关基因表达的影响,初步阐明姜黄素影响3T3-L1细胞成脂分化的可能机制。研究结果显示,与DM组相比,2.5、5、10、15 μmol/L姜黄素处理对细胞活力无显著影响,而20 μmol/L姜黄素处理能显著抑制细胞增殖活力。显微镜下观察发现,与DM组相比,2.5、5、10、15μmol/L姜黄素处理组细胞脂滴沉积量显著降低,油红O染色结果表明,与DM组相比,姜黄素处理组红染阳性细胞明显减少,TG沉积量显著下降,并且呈剂量依赖性抑制作用;此外,姜黄素处理组细胞上清中甘油和FFA释放量也呈剂量依赖性抑制作用。以上结果表明,姜黄素处理能在一定程度上抑制3T3-L1前体脂肪细胞的增殖和成脂分化,呈剂量依赖性。q-PCR的结果显示,姜黄素处理能显著抑制脂肪细胞分化关键转录因子C/EBP-α、PPAR-γ和C/EBP-β,脂肪合成标志基因FAS、SCD和aP2的mRNA表达,并显著增加脂肪分解标志基因ATGL mRNA表达。以上结果说明姜黄素抑制3T3-L1细胞脂质沉积,一方面与抑制成脂分化、减少脂肪合成有关外,另一方面还可能与脂肪分解的增强有关。实验二、姜黄素对猪前体脂肪细胞增殖和成脂分化的作用研究分离断奶仔猪颈、背部皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶分离前体脂肪细胞,细胞达到80%-90%融合时,使用含终浓度为 0.1 mmol/LIBMX,2.5μμmol/LDEX,1μg/mLInsulin 和2 μmol/L罗格列酮的诱导分化液进行成脂分化诱导,并同时添加姜黄素处理,根据姜黄素浓度的不同,共分为5组:①诱导分化对照组(DM,诱导分化液+DMSO);②诱导分化液+2.5μmol/L姜黄素组(DM+2.5μmol/LCur);③诱导分化液+5 μmol/L姜黄素组(DM+5 μmol/L Cur);④诱导分化液+10 μmol/L姜黄素组(DM+10 μmol/L Cur);⑤诱导分化液+15 μmol/L姜黄素组(DM-+15 μmol/LCur);利用CCK法检测细胞增殖活力,通过油红O染色法检测细胞内TG含量,采用q-PCR方法检测脂肪细胞分化关键基因PPAR-γ和C/EBP-β、脂肪合成关键酶FAS和ACC以及脂肪分解限速酶HSL,ATGL和LPL的mRNA表达。应用酶化学法测定细胞内脂肪分解酶的酶活。CCK检测结果显示,与DM对照组细胞相比,2.5、5、10 μmol/L姜黄素处理48 h和72 h对原代培养的猪前体脂肪细胞增殖活力无显著影响,但20 μmol/L姜黄素处理48 h和72 h均显著抑制了细胞的增殖活力。油红O染色结果表明,与DM组细胞相比,10μmol/L姜黄素处理48 h和72 h极显著降低了细胞内TG含量。显微镜下观察也发现,与DM对照组细胞相比,10 μmol/L姜黄素处理组细胞脂滴沉积量明显减少,表明姜黄素对猪前体脂肪细胞的增殖和成脂分化也有一定的抑制作用,并且呈剂量、时间依赖性。q-PCR的结果表明,与DM组细胞相比,10μmol/L姜黄素处理能显著降低脂肪分化成脂过程中两个重要转录因子PPAR-γ和C/EBP-β的mRNA表达,此外,脂肪合成过程中两个重要的合成酶ACC和FAS的mRNA表达也显著下降;另外,姜黄素处理能显著升高脂肪分解限速酶HSL和ATGL的mRNA表达量和酶活。此外,10 μmol/L姜黄素处理能显著增加自噬标志基因LC3和溶酶体酸性脂肪酶LIPA的mRNA表达,并能显著增加LC3蛋白的表达及LC3II/LC3I的比值。以上结果表明,姜黄素抑制猪前体脂肪细胞的成脂分化可能与脂肪合成的抑制及脂肪分解的增强有关,还可能跟自噬激活机制有关。实验三、日粮中添加姜黄素对高脂日粮诱导的C57BL/6J肥胖小鼠模型脂肪沉积的影响选取60只饲养环境、遗传背景等相似的C57BL/6J雄性小鼠(4周龄,15-17 g),随机均分成5组,分别饲喂标准日粮(Normaldiet,ND)、高脂日粮(Highfatdiet,HFD)、高脂日粮和0.1%姜黄素(HFD+0.1%Cur)、高脂日粮和0.5%姜黄素(HFD+0.5%Cur)及高脂日粮和1%姜黄素(HFD+1%Cur),饲喂12周。记录每周体重(Body weight,BW)与采食量;在第4、8、12周分别进行口服葡萄糖耐受试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)并计算曲线下面积(AUC)。试验结束时,记录小鼠体重、附睾脂肪重量,并计算体重增长量及附睾脂肪重量/体重比值,记录肝脏、心脏、脾脏、肾脏、睾丸、腓肠肌及比目鱼肌的重量并计算器官和体重比。检测血浆中脂代谢相关生化指标含量,并通过HE染色法检测附睾脂肪和肝脏组织中脂滴沉积量,并对心脏、脾脏和肾脏组织样等进行病理学分析。研究结果显示,与HFD组小鼠相比,HFD+Cur处理能显著降低小鼠体重、小鼠体重增长值、并能显著抑制小鼠附睾脂肪组织重及附睾脂肪与体重比,并且呈剂量依赖性抑制作用。此外,HFD与HFD+Cur组小鼠的采食量和饲料利用率无显著差异。相对器官重量统计结果显示,与HFD组小鼠相比,HFD+Cur处理对肝脏、心脏、脾脏、肾脏、睾丸、腓肠肌、睾丸的重量并无显著影响,但能显著增加比目鱼肌重量以及肝脏/体重和比目鱼肌重/体重。OGTT实验结果显示,与HFD组小鼠相比,HFD+0.1%Cur、HFD+0.5%Cur和HFD+1%Cur处理能不同程度抑制血糖浓度,并显著抑制AUC值,且呈剂量依赖性抑制作用。血液生化指标显示,低浓度Cur就能显著抑制LDL-C含量、高浓度Cur能显著抑制血浆中TG、Glucose、TCH和NEFA含量,而对AST、ALT和AST/ALT无显著影响。HE切片结果发现,HFD+0.1%Cur、HFD-+0.5%Cur和HFD+1%Cur处理能显著降低附睾脂肪组织和肝脏组织中脂滴的数目及附睾脂肪组织中脂肪细胞的体积,而对心脏、脾脏以及肾脏并无显著病理变化。以上结果显示,日粮中添加姜黄素能显著抑制小鼠附睾脂肪沉积并降低血脂含量,对高脂日粮诱导的肥胖有较好的扭转效果,此外,姜黄素可以显著降低血糖含量,改善葡萄糖耐受。揭示姜黄素可以作为一种潜在调节剂,有效降低体脂沉积、血脂含量和血糖水平,增强葡萄糖耐受,从而为把姜黄素作为一种安全、有效的降脂、降糖饲料添加剂应用于畜牧兽医生产实践提供有力的理论保障。