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水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,全球约一半以上的人口以稻米作为主食。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae;无性态:Pyicularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产的主要限制因子之一。前人的研究表明,稻瘟病系统是一个典型的“基因对基因”模式系统。因此,开展稻瘟病菌无毒基因的研究,能够加深对植物与病原菌之间互作机理的了解,以便更好地培育具有持久抗稻瘟病性的水稻品种。为了克隆并确定稻瘟病菌无毒基因AvrPi7的功能,本文开展了如下3个方面的研究:
1.AvrPi7位点整合电子物理图谱的重新构建及候选基因的确定本研究根据稻瘟病菌参考菌株70-15新、旧版本的全基因组序列的差异,以生物信息学为手段,通过比较基因组学分析,将与AvrPi7基因连锁的标记及AvrPik/kp/km在最新版本的超重叠群中的位置进行整合,由此重新构建了目的基因AvrPi7位点的整合物理图谱。利用电子图位克隆技术,从供体菌株CHL346以及其它稻瘟病菌株中分离、克隆了AvrPi7候选基因,并利用步移法对AvrPi7基因的DNA序列进行了测序分析。
2.候选无毒基因的功能获得性,丧失性遗传互补为了验证AvrPi7候选基因的功能,作者根据供体菌株CHL346的测序结果设计引物,采用PCR技术扩增包含基因内源启动子及终止子在内的全长基因组序列,并克隆到遗传转化载体pBHT2上,以进行功能获得性遗传转化分析。同时,采用PCR技术扩增包含该基因整个ORF的序列,克隆到RNAi载体pSilent-1上,以进行功能丧失性遗传转化分析。结果表明,在目的基因功能获得性实验中,大多数的转基因菌株在毒性菌株CHL688或CHL724的遗传背景下,对与之特异性互作的5个抗病基因(Pik,Pik-p,Pik-m,Pik-h和Pi7)显示无毒。在目的基因的功能丧失性实验中,RNA干涉成功的转化子中,AvrPi7及其等位基因AvrPik/kp/km/kh的无毒性功能完全丧失。上述结果从正、反两个方面确认了该候选基因就是AvrPi7,且该基因就是AvrPik/kp/km/kh的等位基因。
3.无毒基因的定点突变及表达分析为了确定AvrPi7基因CDS区域的3个SNP位点是否为功能性位点,本研究分别构建了这3个位点的定点突变载体。将已突变的基因组装到双元载体pBHT2上,并导入毒性菌株CHL724中。结果表明,定点突变后AvrPi7基因的无毒性功能完全丧失或部分丧失。另一方面,以绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因为报告基因,分别构建了稻瘟病菌强组成型启动子RP27启动的AvrPi7-eGFP载体,以及基因自身启动子启动的AvrPi7-GFP载体,并将这2个构建体以及对照空载体转入毒性菌株CHL688中。结果表明,AvrPi7基因在整个附着胞形成过程中都有表达,且RP27启动的融合蛋白的表达量较高,说明AvrPi7是组成型表达的无毒基因。