新的Poly A RNA结合蛋白Kazrin可能参与细胞内mRNA转运和定位

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tonymin111
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目的:mRNA胞内运输和定位是真核基因表达调控的重要一环,依赖细胞骨架特别是微管系统的主动运输是其中最重要的机制。mRNA如何与马达蛋白(motor protein)相互作用一直困扰着研究人员,我们已经找到一个能够即结合驱动蛋白轻链(kinesin light chain, KLC)又与mRNA相互作用的新蛋白Kazrin,但是它具体与什么RNA相互作用还不清楚,本研究寻找并确定与Kazrin相互作用的核酸序列,探索性研究kazrin在细胞中mRNA转运与定位中的可能作用。方法:与Kazrin蛋白相互作用位点的mRNA序列确定:原核表达Kazrin-GST融合蛋白,与鼠胚和鼠脑总RNA体外结合反应,酚氯仿抽提靶RNA,使用随机引物RT-PCR,TA克隆后筛选阳性质粒送测序。体外使用Northern-western Blot,体内使用紫外交联免疫共沉淀(UV-Crosslinked Co-IP)确定Kazrin蛋白与靶序列的相互作用。使用免疫荧光和原位杂交,激光共聚焦显微镜观察Kazrin蛋白在细胞内定位及与驱动蛋白,微管系统的共定位关系,通过结构分析推测Kazrin蛋白在nRNA细胞内转运与定位中的作用。结果:Kazrin与mRNA结合的靶序列是PolyA,体内和体外的实验证明没有PolyA就没有相互作用。Kazrin在固定的U373细胞中可广泛分布于细胞质和细胞核,与驱动蛋白和微管蛋白在在细胞质中有明显的共定位关系,Kazrin与Poly A RNA在细胞核内共定位。结论:在nRNA细胞内转运与定位的研究领域,我们首次证实一个连接蛋白Kazrin,它既能够与驱动蛋白结合又具有与mRNA直接结合的能力,结合的序列是Poly A。细胞内Kazrin与Poly A RNA可以直接结合形成复合体。激光共聚焦免疫荧光和原位杂技的结果从结构上可以推测Kazrin与mRNA沿微管的主动运输与定位有功能上的关系,但具体的活体证据需要进一步的实验。
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