整合素是普遍存在于细胞中的一种跨膜糖蛋白,广泛参与体内的生理和病理过程,其拮抗剂在抗血小板聚集、抗肿瘤以及抗肿瘤转移中展示出良好的应用前景,是药物开发的一个重要方向。根据阻断受体的作用机制不同,整合素拮抗剂可分为以下两类:⑴抗整合素单克隆抗体如GPIIb/IIIa受体人-鼠嵌合单克隆抗体阿西单抗(Abciximab,c7E3),已获美国FDA批准用于临床,是目前最成功的抗血小板药物;⑵能够封闭整合素结合位点的拮抗剂包括来源于天然生物毒素的解离素(Disintegrin)以及以合成多肽和肽类衍生物等。解离素是主要从蛇毒中分离的能够阻断整合素与其配体结合的一类富含半胱氨酸的小分子多肽,含有精-甘-天冬氨酸(Arg-Gluy-Asp, RGD)、赖-甘-天冬氨酸(Lys-Gluy-Asp,KGD)等序列。RGD序列是ECM及其基底膜中的纤维蛋白原、纤维粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、骨桥蛋白和血管性假血友病因子等所含有的高度保守的氨基酸序列,其与肿瘤细胞、新生血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞表面以及血小板等表面的整合素结合,参与肿瘤细胞的侵润过程。含有RGD序列的解离素可以竞争性地与上述整合素配体结合,干扰肿瘤细胞-ECM或与其他细胞间的相互作用,从而抑制血小板聚集形成瘤栓、肿瘤血管新生,达到抑制肿瘤细胞侵润、转移的目的。本课题拟从江浙短尾蝮蛇蛇毒(Gloydius brevicaudus venom,GBV)中分离纯化解离素,测定理化性质和氨基酸序列,观察其体外抗肿瘤细胞转移作用,为进一步开发利用提供实验依据。1.解离素的分离纯化及部分理化性质测定应用Superdex 75凝胶过滤色谱,从江浙短尾蝮蛇粗毒中分离得到7个蛋白峰;其中蛋白峰Ⅳ可抑制二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板聚集,初步鉴定为具有解离素活性的组分。该组分再通过Sephadex G-25凝胶过滤、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱和Lichrospher C18反相色谱纯化得一个解离素纯品,暂定名为GBVⅣ4。GBVⅣ4在SDS-PAGE(Tris-Tricine系统)凝胶电泳中,呈单一蛋白条带,质谱法测其相对分子质量为7442Da,氨基酸序列测定由70个氨基酸组成,含有RGD三肽活性中心,符合中链解离素特征(约70个氨基酸,6对二硫键)。通过Genbank检索,未发现与GBVⅣ4序列完全一致的氨基酸序列,且GBVⅣ4与其他已发现的解离素有很高的同源性。根据以上实验结果,我们认为GBVⅣ4是一种新的解离素蛋白。2.GBVⅣ4对血小板聚集的影响采用经典的Born法,发现GBVⅣ4在体外可抑制多种聚集剂诱导的血小板聚集,且该作用呈明显的量效关系,GBVⅣ4对ADP、凝血酶诱导的血小板聚集的EC50分别为0.298μg/ml和0.577μg/ml。3.GBVⅣ4对黑色素瘤B16细胞体外粘附的影响细胞-基质粘附实验检测GBVⅣ4对B16细胞粘附能力的影响。相差显微镜下观察两组细胞生长状况,未加药组细胞部分已经展开,成梭形或多边形;加药组细胞形态较圆,且聚集成团簇状。采用MTT法,发现GBVⅣ4可抑制肿瘤细胞与纤维连接蛋白(Fibronection,Fn)的粘附作用,抑制作用呈浓度依赖性,在终浓度16μg/ml时抑制率已达59.34%。4.GBVⅣ4对黑色素瘤B16细胞体外迁移的影响划痕实验检测GBVⅣ4对B16细胞迁移能力的影响。在原始致伤区的基础上,与未用药组比较,实验组细胞在Fn上的迁移均受到明显抑制。5.GBVⅣ4对黑色素瘤B16细胞体外侵袭的影响应用Transwell小室重建基底膜侵袭实验分析GBVⅣ4对B16细胞侵袭能力的影响,药物与细胞作用48h后,细胞穿越基底膜的能力显著低于对照组,细胞侵袭数与药物浓度成反比。结论:从江浙短尾蝮蛇毒中分离得到一个解离素纯品GBVⅣ4,由70个氨基酸组成,含有RGD三肽活性中心,分子量为7442Da。GBVⅣ4能抑制ADP及凝血酶诱导的血小板聚集;GBVⅣ4在体外具有较强的抗肿瘤细胞粘附、迁移、侵袭活性。